AGL1 农杆菌电转感受态细胞 返回列表页

AGL1 农杆菌电转感受态细胞产品组成：

组成                                    BC306-01    
AGL1 Electrocompetent cells             20×50μl      
 pCAMBIA2301 (10ng/μl)                  1 支  
储存条件：-70℃保存，避免反复冻融  
基因型：C58RecA (Rif R /Carb R ) TipTiBo542DT-DNA(StrR ) ,Succinamopine type
产品说明：  

AGL1菌株为农杆菌C58,RecA型背景(Lazoetal.,1991)，核基因中含有抗性基因(Rif)和羧苄抗性基因(Carb)。此菌株还携带一种自身转运功能丧失的质粒(disarmedTiplasmid)，AGL1菌株含有琥珀碱型Ti质粒pAGL0(pTiBo542DT-DNA)，该质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组所必需的元件，pAGL0(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可辅助植物双元表达载体的T-DNA的转移）。pAGL0(pTiBo542DT-DNA)质粒还含有Str抗性基因，赋予AGL1菌株抗性。AGL1农杆菌适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作。AGL1电转感受态特别适用大质粒的转化，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率大于105cfu/μgDNA。

AGL1 农杆菌电转感受态细胞操作方法：   

1. 电极间距为0.1cm的电转杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用）。     

2. 取-70℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入10ng-1μg质粒DNA（洗脱或溶解质粒的溶液中离子不能太高，可用双蒸水稀释。次使用前做预实验确定所加质粒的量），用手管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。   

3. 启动电转仪，设置电击参数：C=25μF，PC=200ohm，V=2.4KV（此参数为BioRad公司推荐，依据不同电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到原来保留的感受态空管中，28℃，150-200rpm，振荡培养2-3小时。   

4. 6000rpm 离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50μg/ml Kan 时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入50μg/ml Kan，20μg/ml Rif 时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50μg/mlRif则需要28℃培养72-90小时）。   

注意事项：   

1. 混入质粒时应轻柔操作，加入质粒的体积不大于感受态体积的1/10，质粒不纯或超大质粒会导致转化效率急剧下降。   

2. 平板上菌落过多时，菌落很小。为了获得大的菌落，应减少质粒用量或减少涂布量，或将菌落转移到新平板上生长。   

3. 使用的工作浓度浓度不应高于25 μg/ml，过高的浓度会降低生长速度和转化效率。   

4. 具有防止杂菌生长筛选农杆菌的作用；根据所用菌株抗性加入或可防止Ti质 粒丢失，但不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时可不考虑添加，Ti质粒丢失的概率极低 (可忽略)。   

Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) A DNA transformation-competent Ara bidopsis genomic library in   

Agrobacterium. BioTechnology 9:963-967。