氨基比林-N-去甲基化酶 活性检测试剂盒 返回列表页

氨基比林-N-去甲基化酶（AND）活性检测试剂盒（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品货号：BA1046

产品规格：100管/48样

产品简介：

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

产品组成：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加入1mL无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉×1管，4℃保存。临用前加入0.5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水4mL充分溶解。

试剂六：液体×1瓶，室温保存。

试剂七：液×1瓶，4℃保存。

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mLEP管，加入10µl标准液，加990µl蒸馏水，混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。

需自备的仪器和用品： 

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

操作步骤：

一、粗酶液提取： 

1. 除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。

2. 粗制微粒体：4℃，100000g，离心60min，弃上清液。

3. 除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g离心30min，弃上清液。

4. 最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

二、AND活性测定步骤： 

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 对照管：取1支EP管，加入10µL粗酶液，170µL试剂二，10µL试剂三，10µL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35µL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35µL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新的EP管，加入100µL上清液，100µL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A对照管。

4. 测定管：取1支EP管，加入10µL粗酶液，170µL试剂二，10µL试剂三，10µL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35µL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35µL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取1支新EP管，加入100µL上清液，100µL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A测定管。

5.  标准管：取1支EP管，加入100µL标准品，100µL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷

却5min，于412nm测定光吸收，记为A标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

三、AND活性计算： 

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

=45×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷Cpr。

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T

 =22.5×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷W。

C标准品：0.05 mmol/L=50µmol/L；

V标准品：100µL=0.0001 L；

稀释倍数：V反总÷V上清液=（10+170+10+10+35+35）÷100=2.7；

Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；

V样：加入粗酶液体积，10µL=0.01mL；

V样总：提取液体积，0.5mL；

W：样本质量，g ；

T：催化反应时间（min），30min。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

=45×（A测定管－A对照管）÷ A标准管÷ Cpr。

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T =22.5×（A测定管－A对照管）÷ A标准管÷W。

C标准品：0.05 mmol/L=50µmol/L；

V标准品：100µL=0.0001 L；

稀释倍数：V反总÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；

Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；

V样：加入粗酶液体积，10µL=0.01mL；

V样总：提取液体积，0.5mL；

W：样本质量，g ；

T：催化反应时间（min），30min。

注意事项：

1. 粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分装后，-80℃保存；

2. 试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用1周；

3. 粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用BCA法测蛋白含量。