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琥珀酸脱氢钠（SDH）活性检测试剂盒（可见分光光度法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品货号：BA1164

产品规格：50管/48样

产品说明：

SDH（EC1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2．6-DPIP的还原速度，代表SDH酶活性。

产品内容：

试剂一：液体60mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体0.6mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入到试剂三中溶解待用；

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL双蒸水，用不完的试剂仍4℃保存；

试剂六：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入3.333mL双蒸水，用不完的试剂4℃保存。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、SDH的提取

准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃11000g离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤和加样表

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

    依次加各试剂到1mL比色皿中，在加入试剂六的同时开始计时；在600nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中，准确反应1分钟；迅速取出比

色皿并擦干，600nm下比色，记录1分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2，得到ΔA测定，ΔA空白。

三、SDH活性的计算

用1mL比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（U/mgprot）＝[（ΔA测定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T

＝1555.556×（ΔA测定-ΔA空白）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（U/g鲜重）＝[（ΔA测定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T

＝1571.111×（ΔA测定-ΔA空白）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性（U/10⁴cell）＝[（ΔA测定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T

＝3.142×（ΔA测定-ΔA空白）

V反总：反应体系总体积，0.98×10^-3L；            ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，21×10³L/mol/cm；  

d：比色皿光径，1cm；                       V样：加入样本体积，0.03mL；

V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；      T：反应时间，1min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；                W：样品质量，g；

500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性失活。

2、若ΔA大于0.5，需将酶液用酶提取液稀释，使ΔA小于0.5，可提高检测灵敏度。