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| 供货周期 | 现货 | 规格 | 100管/96样 |
|---|---|---|---|
| 货号 | BA1436-100 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
产品货号：BA1436
产品规格：100管/96样
产品简介：
乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是乙醇酸循环中的一种酶，也是植物光呼吸代谢中的关键酶，催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸，通过测定乙醇酸氧化酶活性，可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品组成：
产品名称 | 规格 | 储存条件 |
提取液 | 液体60mL×2瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | -20℃ |
试剂三 | 液体2mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前加入2.5mL双蒸水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板UV板、天平、研钵/匀浆器、 冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置冰上待测。
细胞或细菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至324nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。
2. 将试剂一25℃预热15min。
3. 样本测定：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂：
试剂名称 | 测定管 | 空白管 |
试剂一（μL） | 130 | 130 |
蒸馏水（μL） | - | 10 |
样本（μL） | 10 | - |
试剂二（μL） | 40 | 40 |
试剂三（μL） | 20 | 20 |
充分混匀，立即测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2，计算ΔA测定管=A2测定-A1测定，ΔA空白管=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） | ||
GO酶活计算
1. 按微量石英比色皿计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×Cpr）÷T=392.16×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克组织每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×W÷V样总）÷T=392.16×ΔA÷W
（3）按细胞数量计算
酶活定义：每万细胞每分钟生成1nmol乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。
GO酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×500÷V样总）÷T=0.784×ΔA
ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，2×10-4L；V样：反应中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，3min；500：500万个细胞；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
2. 按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。
注意事项：
1. 测定之前进行预实验，若吸光值A1>1，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 色素含量较高的样本，可在提取酶时加活性炭吸附。
3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，其OD值变化不超过0.02。
实验实例：
1. 称取约0.1g三叶草组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清进行检测，使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.8956-0.7839=0.1117，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1117-0.0083=0.1034，按样本质量计算酶活得：GO酶活（U/g 质量）=392.16×ΔA÷W=405.4934 U/g 质量。
2. 称取约0.1g菠菜组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清稀释2倍进行检测，使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.9286-0.8105=0.1181，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0853-0.077=0.0083，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1181-0.0083=0.1098，按样本质量计算酶活得：GO酶活（U/g质量）=392.16×ΔA÷W×2（稀释倍数）=861.1834 U/g质量。
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