流式ROS检测 返回列表页

01选择荧光探针常用的荧光染料是DCFH-DA，它能够进入细胞并在细胞内被酯酶水解成DCFH。DCFH随后可以被细胞内的活性氧氧化，生成发荧光的DCF。

02DCFH-DA是一种用于检测活性氧ROS的荧光探针，全称为2,7-二氯荧光素二乙酸酯。其工作原理为：DCFH-DA本身没有荧光，但可以自由穿过细胞膜，一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH，由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。

03步骤装载探针

对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。