Universal SYBR Green qPCR Mix

储运条件

长期保存请于-20℃避光保存，Mix 融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。

产品组分

Universal SYBR Green qPCR Mix 

产品简介

Universal SYBR Green qPCR Mix 是SYBR® Green I 嵌合染料法专用qPCR 试剂，为2× 预混液，包含除引物和DNA 样品以外的所有qPCR 组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA 聚合酶，配合精心优化的Buffer 体系以及PCR 反应促进因子，使产品具有特异性强、扩增效率高等特点，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR 结果。预混液中含有通用校正染料，与绝大多数 qPCR 设备兼容，包括需要 ROX 校正的仪器，实验过程中一般不需要额外添加校正染料。

使用方法

1. 使用注意

① 因Mix 中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；

② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡;

③ Mix 中含有Universal 校正染料，适用于所有机型，无需额外添加染料。

2. 建议的qPCR 反应体系

a. 通常推荐的引物终浓度为0.2 μM，反应效果不佳时可在0.1~1 μM 范围内进行调整；

b. 推荐模板加样量为1~2 μl，如模板类型为未稀释cDNA 原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA 模板添加量。

3. qPCR 反应程序（可根据机型适当调整）Universal SYBR Green qPCR Mix

两步法

三步法

a. 根据引物的Tm 值进行退火& 延伸（退火）温度的设定；若扩增片段在200bp 以内，退火& 延伸（延伸）时间可以设置为15 sec；此外，退火& 延伸（延伸）时间的设置还需根据您使用的qPCR 仪所需要的最短数据采集时间自行调整；

b. 不同qPCR 仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。

4. 实验优化

若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：

① 引物浓度调整

当引物终浓度在0.1~1.0 μM 范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。

② 扩增程序优化

需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

5. 引物设计原则

① 扩增产物长度建议控制在80~200 bp；

② 引物长度为18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超过1℃为佳，Tm 值控制在58~62℃为佳；

④ 引物的GC 含量控制在40%~60% 之间；

⑤ 引物A、G、C、T 整体分布尽量要均匀，避开T/C 或者A/G 的连续结构（特别是3' 端）；

⑥ 引物3' 端最后一个碱基最好为G 或者C；

⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；

⑧ 使用NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性。

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