接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
该方法除了具有以上全部优点，并且可以纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液

1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。

操作建议：

先收集菌体；
然后采用碱性裂解法制备原料；

再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩：

氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质

裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:

1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;

5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。

（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。

步纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；

步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。

随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

层析条件

*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从 超螺旋（SC）级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。

该步骤进一步去除了杂质。

层析条件

*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

1. 调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。

2. 用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。

3. 将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。

4. 用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。

5. 用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

6. 用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。

7. 加样 3 次后，对柱子进行清洗。

图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA

· 从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋