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体外连接法

将外源基因的表达盒亚*到腺基因组的一个片段上,在体外与腺的基因组相连,重新构建成一个完整的腺DNA 分子,转染敏感细胞,即可获得重组腺病毒〔10〕。但腺病毒基因组上适宜于*的酶切位点有限,因而限制了该法的应用。目前,可利用该法构建全缺失载体。

同源重组法

实验中常将具有共同或重叠序列的两种DNA 分子,通过共转染转移到某一生物体内,在生物体内一系列与同源重组有关的酶的作用下,将DNA 片段由一个DNA 分子(常为含有外源基因的穿梭质粒) 转移到另一个分子(常为含有骨架结构的质粒) 中去。生物体不同,构建载体的方法各异。在真核细胞中进行同源重组:分为哺乳动物细胞和酿酒酵母细胞两种。前者常用的为293 和911 细胞,源于人胚肾及人胚成细胞,已整合腺基因,可表达腺E1蛋白,用于增殖E1 区缺失的腺载体。

构建时,需历经筛选及噬斑纯化等过程,效率低、费时,且技术条件要求高。已报道利用酿酒酵母细胞经过两次重组过程将外源基因置换到腺的基因中,与哺乳动物细胞相比,用酿酒酵母细胞构建腺载体有一定的*性。例如,可用Southern 杂交技术直接鉴定酵母细胞*中是否含有腺载体,易于获得重组的阳性 但重组前要将完整的腺基因组*到酵母人工染色体( YAC) 中,并需要从较大量(至少500 ml) 培养基中培养的酵母细胞里提取YACs ,重组时,要在拟重组的区域内,将腺DNA 分子线性化,由于涉及的DNA 分子较大,做到此点有时也并非易事。

在原核细胞中进行同源重组:所有*的操作,尤其是同源重组的过程可利用大肠埃希菌高效的同源重组机制在工程菌(如BJ5183) 中完成,重组效率高,在转染真核细胞前已完成对载体的鉴定工作,因而避免了反复鉴定及纯化的麻烦,大大缩短生产载体的时间,可在20 d 内获得重组腺〔14 ,15〕。目前,许多实验室正在利用该法制备重组腺。