流动相是影响液相色谱的关键因素。一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液。但是如何配制，选择配制的方法不同，分析结果特别是保留时间，是会有显著差别的。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液，水性溶剂也常用于缓冲液。常因资料上表示的内容和实际的配制方法不同，而产生流动相的差异，影响了色谱图和分析结果。一般来说，溶剂的混合按体积比（V/V）或重量比（W/W）进行。溶液的体积因温度而变化，所以按重量比混合可调制再现性较好的混合溶剂，但由于操作较麻烦，通常多用体积比混合。只要没有特别标明，就可按体积比进行混合，但在特殊情况下，如胺类粘度高的溶液混合时，有时用重量—体积比（W/V）的方法。

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：