Phoreusbiotech支链两亲性肽胶囊在昆虫饲料中传递致死性的研究

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开发新的和特定的害虫管理方法对于克服杀虫剂抗性和附带的非目标害是至关重要的。通过向昆虫提供 dsRNA 来实现基因沉默在这一领域显示了希望。在这里，我们描述了一种多肽纳米材料的使用，分支两亲肽胶囊(BAPC) ，促进细胞摄取双链 RNA 的昆虫通过喂养。昆虫饲料包括与 BAPC 络合的和不与 BAPC 络合的 dsRNA。选取的昆虫品种来自两个不同的目，以不同的取食机制: 赤拟谷盗和碗豆蚜。测试的基因转录本(BiP 和 Armet)是未折叠蛋白反应的一部分，抑制它们的翻译会导致致命性。对于无芒草属，与摄入相同量的游离 BiP-dsRNA (t1/2 = 11-12天)相比，摄入与 BAPC 相关的 BiP-dsRNA 导致蚜虫过早死亡(t1/2 = 4-5天)。使用 BiP-dsRNA 和与 BAPC 复合的 Armet-dsRNA 的组合有效地杀死赤拟谷盗; 大多数在幼虫或羽化期间死亡(? 75%)。单独喂食 dsRNA 导致较少的死亡(约30%)。结果表明，双链 RNA 与 BAPC 的复合增强了双链 RNA 的口服递送。1.前言我们最近描述了一类由支化两亲肽胶囊(BAPCs)制成的新型纳米材料[1]。这些纳米胶囊具有不寻常但非常理想的特性，可以解决与其他纳米颗粒相关的一些缺点[2]。例如，它们是水溶性的，在血液中稳定，*由天然氨基酸制成[3]。它们显示大小(取决于退火条件) ，范围从10到50纳米，并耐洗涤剂，蛋白酶和混沌[4,5,6]。本研究中使用的 BAPC 由两种分支肽: 双(AcFLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和双(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2的等摩尔混合物组成，并且来源于人心脏 L 型二氢吡啶敏感钙通道的孔形成片段之一[1]。这些纳米胶囊有望作为一种替代的非病毒核酸载体，体外和体内系统[3]。在体外，DNA-BAPC 纳米颗粒已被用于转染多种细胞系，包括 HEK, HeLa 和小鼠树突状细胞的转染效率高于普遍使用的基于脂质的商业产品，细胞毒性可以忽略不计[3]。在体内，BAPC 能够在小鼠体内传递编码 HPV-16(pgDE7) E7癌蛋白的疫苗 DNA。用 pgDE7-BAPC 纳米胶囊复合物免疫的小鼠在肿瘤细胞移植后一个月内抑制肿瘤生长，没有明显的毒性作用[3]。基于两种不同成像技术的物理 BAPC/DNA 相互作用的研究揭示了平均大小在50nm3到250nm3之间的致密团簇。与 DNA 的组蛋白压缩形成核小体相比，20-30nm 的 BAPC 与质粒 DNA 相互作用，作用于带负电荷的 DNA 与外表面结合的无性成核中心[3]。这些结果表明，BAPC 促进质粒 DNA 和其他类型的核酸，如小寡核苷酸或 RNA 的摄取。DsRNA 进入细胞是当代分子生物学中最有用的工具之一的第一步: 通过RNAi [7,8].基于 RNAi 的转录本敲低已经在许多目的昆虫中使用，并且是昆虫反向遗传学工具箱的关键部分[9]。DsRNA 构建体已经通过显微注射到血淋巴中，主要用于昆虫[10]。虽然有效，但注射也有其局限性，包括治疗大量昆虫的单调乏味和注射较小的昆虫种类(或发育早期)的困难。除了注射，诸如浸泡[11]和摄取的方法已经被探索，但成功和重复性有限。最近，一些研究表明，摄取与纳米材料相关的 dsRNA 可以增强沉默活性[12,13,14]。已经观察到阳性结果形成 dsRNA 与阳离子脂质和修饰的多糖如壳聚糖的复合物[12]。然而，尽管这种进展，RNAi 效应是低和高度可变的。该领域的共识，主要来自不成功的，因此未发表的研究，是喂养昆虫的 dsRNA 在好的情况下是低效的，在最坏的情况下是*无效的[8]。在这项研究中，BAPC 被测试的能力，促进摄取 dsRNA 的昆虫通过喂养，以增强转录敲低。昆虫饲料包括含有和不含有 BAPC 络合物的 dsRNA。选择的昆虫种类来自不同的目和不同的取食机制: 赤拟谷盗(Tribolium castaneum)用改良的固体面粉饲料喂养红粉甲虫，豌豆蚜(pea aphid)用人工液体饲料喂养碗豆蚜。这两种昆虫的基因组序列已经发表。Tribolium 是一个主要的遗传模型，其中通过 dsRNA 注射的转录敲低可能比任何其他昆虫物种更有效[17]。此外，它还是一种与人类生物化学和细胞生物学过程有关的模式生物[17]。作为这两个物种的主要靶标，我们选择了 BiP (GRP78)的转录本。它的活性在未折叠蛋白应答(UPR)中是重要的[18]。对于 Tribolium，我们包括另一个普遍定期审议成员 Armet (也称为 MANF)的转录本[19]。在 Tribolium 的一个单独的实验中，我们敲除了 Vermillion 转录本，作为*内部器官中的转录本的例子(与肠道相反，肠道是敲除 BiP 和 Armet 转录本的可能作用部位)。朱砂编码的氧化酶，所需的棕色眼睛色素合成在 Tribolium [20]。摄食 BAPC-Vermillion-dsRNA 复合物导致处理昆虫眼睛颜色不深。在另一个实验中，用 BAPC/dsRNA 复合物处理后，荧光标记的 dsRNA 定位于解剖的成年 Tribolium 的内脏。RNAi 技术在消除病虫害方面具有巨大的潜力，但需要进一步的实验来确定可获得的细胞靶标中的合适的基因靶标，使用的方法可以很容易地缩放。本报告中描述的生物胶囊促进了在体内口服递送具有高效率和低细胞毒性的 dsRNA (纳米胶囊单独使用)的系统。形成胶囊的自组装肽容易以高纯度合成，在纯水中组装，并且可以在存在 dsDNA 或 dsRNA 的情况下在复水之前长时间储存。这些肽的合成很容易被缩放到多重水平，并且每次处理所需的 μM 浓度较低，使用这些载体的成本应该使得任何研究人员都可以使用这种工具来在高价值的情况下控制害虫。

材料及方法2.1。多肽合成如前所述合成并切割支化的两亲肽双(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和双(Ac-FLIVI)-K-K4-CO-NH2[1]。切割后的肽用二洗涤三次，溶于水中，冻干后放入室温下保存。反相高效液相色谱纯化多肽，基质辅助激光解吸/电离时间飞行(MALDI TOF/TOF)进行表征。双(Ac-FLIVIGSII)-K-K4-CO-NH2和双(Ac-FLIVI)-KK4-CO-NH2分别溶于纯2,2,2-三氟乙醇(TFE)中，并以等摩尔比混合在一起，最终浓度为1mM。使用在257.5 nm (195cm-1M-1)水中的摩尔吸收率(ε)计算肽浓度。混合后，他们允许停留10分钟，然后在真空下除去溶剂。将1mL 水滴入干燥的肽混合物中，并使其在25 °C 下静置30分钟，以1mM 终浓度形成胶囊。随后，将含有溶液的胶囊在4 °C 温育1小时以防止胶囊融合[4]。1小时后，将肽样品放回25 °C 30分钟，然后干燥，进行对数贮存或与 dsRNA 混合。2.3.DsRNA-BAPC 纳米颗粒的制备为了处理10只赤拟谷盗甲虫，将含有10μg Armet、 BiP 或朱砂的200μL 水溶液分别滴加到含有400μMBAPC 的200μL 水溶液中，或将 Armet 和 BiP 一起滴加到200μL 水溶液中。对于用 BiP-dsRNA 和 Armet-dsRNA 的组合处理的组，我们加入每种5μg 并以400μM 与200μL BAPC 混合。溶液通过移液管小心地混合，并允许在加入 CaCl2之前停留10分钟，以产生1.0 mM 的最终浓度。培养30分钟后，将溶液与昆虫饲料混合。为了处理5种碗豆蚜蚜虫，将0.1 μg 的 Acyrthosphopisum BiP-dsRNA 溶于10μL 水中。随后，将该溶液滴加到含有200μM BAPC 的10μL 溶液中。溶液小心地与移液管混合，并允许在加入产生1.0 mM 最终浓度的 CaCl2之前停留10分钟。在另外10分钟的疾病潜伏期后，加入蔗糖(500毫米)。对于用较少量 BiP-dsRNA 处理的昆虫，如上所述制备的 BAPC/核苷酸复合物在加入 CaCl2之前用水稀释10倍和100倍。

2.4.动态光散射(dLS)和 zeta 电位(ZP)如前所述制备了不同的 dsRNA-BAPC 制剂(dsRNA-BAPC 纳米颗粒的制备)。所有样品的粒径和 zeta 电位均使用 Zetasizer Nano zS (Westborough 马萨诸塞州莫尔文仪器有限公司)测定。样品在 CaCl2(2mM)中分析，所有测量一式三份进行。原子力显微镜如前所述制备 dsRNA-BAPC 复合物并用天然氧化物沉积在硅衬底上。使用来自 ParkSystems (韩国)的 ParkXE7 AFM 以非接触模式获得地形图像，使用标称端直径为14nm 并标称弹簧常数为42N/m 的硅悬臂梁(ParkSystems，PPP-NRC)。硅衬底表面有一层薄的天然氧化物(约1-2nm)(未进行 HF/BOE 蚀刻)。

2.6.根据 Mutti 等[21]的研究，豌豆蚜(Acyrthosphon pisum)被关在蚕豆属(Viciafaba)植物的笼子里。所有的饲养试验生物测定都在22 °C 下进行，并编程为16小时的光照和8小时的黑暗周期。以含5% 啤酒糟的面粉为饲料，在30 °C 下饲养赤拟谷盗(GA-1)昆虫。Avila 等人。控制释放杂志273(2018)139-146140酵母在标准条件下如前所述[22,23]。通过混合70毫克黄金水牛粉(Heartland Mill，Inc.)制备了含 ds-RNA-BAPC 纳米颗粒(赤拟谷盗)培养基的饲料，用于喂养10只昆虫。如前所述，用400μL dsRNA-BAPC 复合物制备的 Marienthal，KS)。将面粉与双链 RNA-BAPCs 溶液反转几次混合。这种混合物在真空下保持大约10小时。当混合物*干燥后，我们将其分配到96孔板中，每孔加入7毫克左右。立即，我们放置一个昆虫每孔(幼虫和/或蛹前阶段(质量约2毫克)。对于仅含有 dsRNA 的对照组，我们将70mg 金牛花粉与溶于400μL 水和160mM CaCl 2中的10μg Armet-，BiP- 或 Vermilion-dsRNA 混合。其他对照通过将70mg 面粉与400μL 水加减 BAPC (40μM)混合制备。我们分析了每组30-35只动物。动物被保持在30摄氏度的定时期与视觉监测的表型和死亡率2.8.对于对照样本，将蚜虫放置在含有灭菌的2% 琼脂(补充有0.1% 奇迹生长肥料和0.03% 甲基碗豆蚜)的培养皿中，插入健康的叶子(蚕豆) ，并喂食48小时[24]。对于 dsRNA 喂养试验，将多达5只成年蚜虫(没有过度拥挤)用细漆刷转移到喂养无菌塑料杯(Falcon，Primaria，NJ，USA)上。在含有5只昆虫杯的塑料杯上放置一层拉伸的石蜡膜(美国费舍尔科学研究所)。将含有游离或 BAPC 缀合的 BiPdsRNA 的人工饲料(20μL)置于在杯上拉伸的膜的顶部。第二层拉伸膜被放置在饮食的顶部，从而形成口袋。蚜虫通过穿透膜的底层进食。采用0.1 μg、0.01 μg 和0.001 μg 含12.5 mM CaCl _ 2的三种不同浓度的 dsRNA。蚜虫被允许以这种食物为食48小时。然后将蚜虫转移到如前所述为对照组准备的植物叶片中。在每个实验中，三个重复包括在人工饲料喂养。在每个饲养试验中，每组10 × 3只蚜虫分别进行存活试验。每个实验组每天进行监测，记录并清除死亡的成年蚜虫和若虫。2.9.根据制造商(Invitrogen，CA，USA)提供的提取 RNA 的方案，在1mL TRIZOL 试剂中用聚丙烯杵匀浆成年蚜虫(10种昆虫)。按照 tURBO 无 DNA 试剂盒(Ambion，Austin，TX)提供的方案处理 RNA 分数，可将 dsRNA 样本中的 DNA 污染降至低。使用 SuperScript III FirstStrand 合成系统进行 RT-PCR (Invitrogen，CA，USA) ，将 RNA (4μg 无 DNA)反转录成互补DNA (cDNA)。对赤拟谷盗幼虫(7种昆虫)进行了类似的处理。两种昆虫目标基因的核苷酸序列(豌豆蚜: p-BiP: NCBI 登录号。从 NCBI 数据库获得 XM _ 003244000.1) ; 赤锥菌: TcBiP: XM _ 015982882.1; TcArmet: XM _ 966545.3; TcVer: NM _ 001039410)。使用 AmpliScribeTM T7 Flash TranscriptionKit 方案(Cat。没有。美国震中生物技术公司 ASF3507)。PCR 产物在40mM 三醋酸盐(pH8.3)和1mM EDTA 中制备的1.4% 琼脂糖凝胶上分离。溴化乙锭加入至0.7 μg/mL 的最终浓度，然后让琼脂糖凝固。在紫外光下拍摄凝胶并通过凝胶文档(UVP-Digital Image System，Upland，CA，USA)捕获图像。2.11.在未修饰的 Armet-dsRNA 的5′端引入了 Armet-dsRNA 巯基的荧光标记。使用5’0EndTAg 核酸标记试剂盒(Vector Laboratories，USA)掺入巯基官能团。随后，我们纳入了巯基反应性荧光标记 Atto633-Maleimide (Atto-Tec GmbH，Germany)。简而言之，将0.4 nmol 的 Armet-dsRNA 在37 °C 温育30分钟。与 ATPγ S 和 T4多核苷酸激酶(T4-PNK)。T4-PNK 将硫代磷酸从 ATPγ 转移到双链核酸的5′羟基上。接下来，将 Atto633-马来酰亚胺染料加入过量的3M 中，并在室温下孵育3小时，保持 pH = 8以确保巯基的去质子化。在这个疾病潜伏期之后，用缓冲分离 dsRNA。在纯化完成后，使用纳米滴方法读取浓度，并通过荧光测量确认标记。对于饮食制剂，荧光标记的 Armet-dsRNA 按照前面描述的方案与 BAPC 混合。接下来，将400μL (10μg)标记的 Armet-dsRNA (游离的或与 BAPC 复合的)与100mg 面粉混合。这些混合物在真空下保持大约10小时。当两种混合物*干燥后，它们被分配到一个96孔的平板中，每孔加入10毫克以治疗赤拟谷盗10的幼虫。为了比较的目的，另外一个控制组包含只有水的饮食。

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