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细胞生长培养基和蛋白质生产

使用基于细胞的表达系统制备富含同位素的蛋白质是制备用于 NMR 分析的样品的常用方法。迄今为止，用于表达标记蛋白的流行的生物体是大肠杆菌。哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞用于表达蛋白质。大肠杆菌不能以可用的形式表达蛋白质。

CIL 提供了一系列丰富的试剂和产品来标记大肠杆菌、昆虫、酵母和哺乳动物细胞，以生产适用于 NMR 实验的均匀或选择性标记的蛋白质。

细菌培养基

使用 e. 蛋白的过度表达。大肠杆菌是获得标记蛋白质用于 NMR 研究的流行方法。这是通过增加 e 来实现的。大肠杆菌细胞并在适当的富含同位素的细胞培养基中诱导蛋白质表达。基本培养基是仅包含葡萄糖或甘油或丙酮酸作为表达蛋白质的碳源和氯化铵或硫酸铵作为氮源的细胞培养基。丰富的培养基含有氨基酸以及用于蛋白质生产的一定水平的葡萄糖。

CIL 提供多种产品，用于表达用于 NMR 研究的标记蛋白质。这些包括用于基本培养基的试剂以及可直接使用或用水稀释后即可使用的丰富细菌细胞培养基。CIL 还提供 Celtone 粉末，一种标记添加剂，用于基本培养基以及 Spectra 9 培养基，一种基本培养基，每升含有 1 克 Celtone 粉末。CIL 也销售 e。由位于德国慕尼黑的 Silantes Gmbh 公司生产的大肠杆菌 OD 培养基。

昆虫细胞培养基

将杆状病毒表达系统 (BEVS) 用于在同位素标记培养基中培养的昆虫细胞已被证明是生产同位素标记膜蛋白，最显着的是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 的成熟技术。CIL 自豪地开创了一种化学成分确定的培养基，该培养基已用于草地夜蛾 (SF9) 细胞。这种培养基 BioExpress 2000® 可以用统一标记或氨基酸特异性标记制造。未标记的试验尺寸可用于在使用标记介质之前检查可行性和优化。请参阅 CIL 应用说明 14（“使用 BioExpress2000®（昆虫细胞）培养基对杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的蛋白质进行有效均匀同位素标记"）和 20（“有效位点特异性同位素标记（13C15N 甘氨酸；13C15N苯丙氨酸；15N 色氨酸）使用 BioExpress2000® 培养基进行表达优化"）以获取更多信息。

哺乳动物细胞培养基

随着目标蛋白质的大小和复杂性增加，获得在大肠杆菌中表达的正确折叠蛋白质的可能性。大肠杆菌减少。然后必须转向使用真核细胞表达蛋白质，其中哺乳动物细胞系通常是选择。CIL 自豪地提供 BioExpress 6000®，这是一种细胞培养基，适用于培养数量有限的哺乳动物细胞系。BioExpress 6000® 是一种化学成分确定的培养基，其配方以 DMEM 为模型，因此非常适合培养 HEK293 细胞。要确定 BioExpress6000® 是否支持特定细胞系的生长，建议先在 DMEM 中培养细胞。如果 DMEM 支持细胞的生长，那么 BioExpress6000 也应该起作用。如果细胞需要存在胎牛血清 (FBS) 或胎牛血清 (FCS)，然后应将透析过的 FBS 或 FCS 与 BioExpress 6000® 结合使用。BioExpress 6000® 以粉末形式提供，并附有复原说明。通常培养基含有 CaCl，但是，CIL 提供了一种不含 CaCl2 的版本，用于非粘附生长。由于 BioExpress 6000® 是化学定义的，用户可以需要标记的氨基酸（目录号 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 还提供未标记的 BioExpress 6000® 以在购买和使用标记版本之前评估生长情况。用户可以需要标记的氨基酸（目录号 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 还提供未标记的 BioExpress 6000® 以在购买和使用标记版本之前评估生长情况。用户可以需要标记的氨基酸（目录号 CGM-6500-CUSTOM）。CIL 还提供未标记的 BioExpress 6000® 以在购买和使用标记版本之前评估增长。

酵母培养基和试剂

酵母是流行的用于蛋白质表达的真核细胞类型。酵母细胞易于生长、遗传操作，并且可以产生高产量的表达蛋白。用于生产用于 NMR 目的的标记蛋白质的三个属是毕赤酵母属、酵母属和克鲁维酵母属。Cambridge Isotope Labs 很高兴为酵母表达和培养基提供各种标记碳源。

叶酸循环

叶酸代谢途径在许多生理过程（例如氧化还原和氨基酸稳态）和生化反应中起着核心作用。反应包括但不限于核苷酸和氨基酸（例如甲硫氨酸、高半胱氨酸）的合成和线粒体蛋白质翻译。受抑制或异常的功能与全身性疾病（例如心血管疾病、神经退行性疾病）有关。为了协助化合物识别/量化及其功能评估，CIL 提供了一系列与叶酸循环相关的代谢物。产品中包括代谢物 5-甲基-四氢叶酸（5-甲基-THF），它与蛋氨酸循环有关，以及其他代谢中间体和反应物。这些主要以其整洁的形式作为研究级材料提供。

糖酵解

糖酵解是在 10 步反应中将葡萄糖转化为丙酮酸的代谢途径，同时利用释放的能量进行细胞代谢。这种分解代谢途径是普遍存在的，发生在原核和真核细胞中。为了补充该途径中代谢物的分析，CIL 很高兴提供许多其稳定同位素标记的化合物。该化合物产品包括途径终点（即葡萄糖和丙酮酸）及其中间体（例如，6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸）。这些化合物是研究级的，主要以纯净形式提供。

类固醇和激素

类固醇激素在许多生理过程（例如，水和电解质平衡）的调节中起着至关重要的作用。这组化合物分为 5 个主要类别：雄激素（例如二氢睾酮、睾酮）、糖皮质激素（例如雄烯二酮、脱氧皮质醇）、盐皮质激素（例如醛固酮）、雌激素（例如雌二醇、雌酮）和孕激素（例如，孕酮）。类固醇激素的准确定量对于基础和转化研究至关重要，可以通过将稳定同位素标记的类固醇标准用于液相色谱 (LC-) 或气相色谱 (GC-) 质谱方法来实现。

CIL 以纯净和/或溶液形式提供未标记和稳定同位素标记的甾体激素。请在下方查看我们的类固醇激素的可用性、价格和规格，并询问是否需要更多信息或替代产品/标签。其他资源是用于代谢研究的稳定同位素标记产品目录。

代谢同位素分析利用稳定的同位素丰富的底物和质谱法来研究活细胞和组织的新陈代谢。由于同位素标记的底物可以确定活细胞或组织中的代谢途径和通量，mia 已经成为肿瘤学研究的一个整合平台。这个应用说明提供了一个用于研究小鼠代谢和培养人类细胞的例子，用于肿瘤学研究，总结了 nicolay 等人以前进行的研究，这些研究人员利用 mia 来研究苍蝇模型中的视网膜母细胞瘤蛋白抑癌基因(prb)的失活。在提交的研究中，nicolay 和他的同事发现，成年小鼠组织中 prb 的急性缺失导致了葡萄糖氧化的快速变化(nicolay 等，2015)。这一随后的研究表明，葡萄糖衍生的中间物在血液循环的线粒体在 prb-/-组织的功能低于 prb +/+ 组织。这些效应在 prb 缺失的人类细胞培养模型中被模仿。13c6-葡萄糖(cil 目录编号: 1)的体内同位素分析。Clm-1396)在结肠和肺部使用类似于以前发表的工作的协议进行(范等人，2011; 莱恩等人，2011; yuneva 等人，2012; sellers 等人，2015)。简单地说，给小鼠注射13c6葡萄糖，20分钟后处死小鼠进行组织分离。最初的时间进展分析发现，注射20分钟后，血液中13c6-葡萄糖的水平已经达到高峰，并且在糖酵解和 tca 循环的下游中间环节中持续了13c 的富集(图1a-d)。以确定 rb +/+ 和 rbko 小鼠的葡萄糖清除率相似, 13c6- 葡萄糖浓度相同的葡萄糖耐量试验(gtt)显示，诱导后96 hrsafre 基因型之间没有差异(图1e)。这些对照实验表明，用这个方法可以确定葡萄糖代谢产物的质量差异。为了支持 gtt 的结果，对血清中13c6-葡萄糖摄取的分析显示 rb +/+ 和 rbkotolon 或肺组织之间没有差异(图2a)。相反，rb1的缺失引起两组织中 m + 2柠檬酸盐的显著富集(双倍)(图1f)。组织中 m + 3丙酮酸或 m + 3乳酸的产生量没有差异(图1g，h)。有趣的是，在 rb1丢失后并没有发现糖酵解增加(丙酮酸和乳酸的产生表明了这一点(图2b，c))。这个奇怪的结果表明，红细胞组织增加了葡萄糖进入 tca 的浓度。与此一致的是，一种定性测定丙酮酸脱氢酶(pdh)活性(m + 2柠檬酸/m + 3丙酮酸)的比率在 rb1丢失时显著升高(图1i)。此外，在两个 rbko 组织中均观察到 m + 2乙酰辅酶 a 明显富集，在 rbko 肺组织中总乙酰辅酶 a 明显增加(图1j-k)。用这种方法我们不能直接定量测定 tca 循环活性。尽管如此，结果表明 prb 在体内的丢失并不会产生糖酵解表型，尽管进入 tca 循环的葡萄糖增多，但在相对高能条件下，atp 的产量却下降了。引人注目的是，rbko rpe 细胞表现出明显增加的充实 m + 2柠檬酸盐(图3a)。这种效应再次与图1。体内13c6-葡萄糖分析 rb 的丢失对 tca 循环进入的影响。(a)13c6-葡萄糖命运通过丙酮酸氧化作用绘制 tca 循环图，红圈为13c，开放圈为12c。丙酮酸*由13c 组成，标记为 m + 3。使用的缩写是: accoa-乙酰辅酶 a; alphakg-α- 酮戊二酸; co2-co2-succinate; mal-malate; fum-fumarate; oac-oxaloacetate; pyr-pyruvate。(b-d)对照组小鼠血液和组织中13c6- 葡萄糖链的动力学进行了研究。结果显示，13c6- 葡萄糖注射后的时间点(i/p) ，小鼠血液或组织中13c6- 葡萄糖的富集率为9-24。(b)13c6葡萄糖从血液中清除的动力学。(c-d)13c6-葡萄糖氧化为糖酵解(m + 3丙酮酸盐)和柠檬酸三钙循环(m + 2柠檬酸盐)中间体的动力学。数据趋势是结肠和肺组织的代表; 显示为结肠样本的数据。(e)糖耐量试验(gtt)显示 rb 丢失后96h 小鼠基因型间葡萄糖吸收相似，n = 4小鼠/基因型。(f-h) rb 损失使结肠和肺中13c6葡萄糖衍生物升高，但不影响13c6葡萄糖衍生物丙酮酸或乳酸盐，n = 8小鼠。(i) pdh 活性比(m + 2柠檬酸/m + 3丙酮酸)。Rb 丢失会导致结肠和肺部 pdhactivity 升高。(j-k) rb 的丢失增加了葡萄糖衍生的乙酰辅酶 a 的富集，增加了乙酰辅酶 a 的总库。(l) rb 的损失影响体内的 atp 水平。误差线是95% 的置信区间。P 值的统计显著性如下: * < 0.05，* * < 0.02，* * < 0.001。Rb-/-和对照细胞的影响有统计学上的差异。

Pdh 活性升高的比率(图3b)。这些结果表明 rb/rb1消融同样影响小鼠和人睾丸组织丙酮酸氧化，而且这种变化与 rb/rb1消融对细胞增殖的影响无关。与细胞内分析不同，视网膜色素上皮细胞中13c6葡萄糖的24小时脉冲，会产生非标记的13c 柠檬酸盐。由此我们估算了柠檬酸 m + 4/m + 2之间的 tcacycle 活性。M + 4柠檬酸代表13c 浓缩柠檬酸通过 tca 循环的第二个过程(图1a)。因此，一个更大的比例将反映一个加速的 tca 周期。Rb1的丢失严重降低了这个比率(图3c) ，证实了这些细胞的 tca 周期确实减少了。由于谷氨酰胺在体外的 tca 循环中也是一个大的碳氧化来源，我们对13c5- 谷氨酰胺衍生的 tca 中间体进行了类似的加脂处理，我们发现在 rbko rpe 细胞中13c5- 谷氨酰胺的氧化作用也减弱了(图3d)。鉴于 rb1突变导致线粒体容量下降，我们测试了这些变化是否会造成细胞易感性。因此，我们将对照 rpe 和 rbko rpe 细胞培养72小时，葡萄糖浓度从5mm 降低到1mm。令人印象深刻的是，与对照细胞相比，这种营养物质的转移本身导致 rbko rpe 细胞的生长减少了50% (图3e)。加用两种不同的氧化磷酸化抑制剂(鱼藤酮和苯乙双胍，两种 ci 抑制剂)进一步降低 rbko rpe 细胞与同样处理的对照细胞相比的活性(图3 f)。这些结果有力地支持了 rb/rb1的丧失会损害氧化磷酸化能力的结论，并表明线粒体的变化具有生理后果。关于研究方法和进一步的研究细节，请参阅 pubmedpmd: 26314710。

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