细胞冻存是细胞培养技术中细胞进行保种并长期保存的常用方法，其中细胞冻存液，作为细胞冻存时必须使用的一种溶液，不仅仅是说只是用来进行细胞的保存，在细胞的购买、寄赠、交换和运送过程中也起着关键作用，因此选择一款好的细胞冻存液就尤为重要。

 

细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作为保护剂，最大限度的保存细胞活力。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。同时，有些保护剂在细胞外也能减轻溶液中高浓度溶质对细胞的损伤，进一步避免细胞在冷冻和复苏过程中受到损伤。渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂血清（主要含白蛋白）是使用最为广泛，效果最为稳定可靠的。

 

此外，采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/分钟，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

 

现有冻存方法存在的问题：
1、DMSO对细胞存在一定的毒性，用量受到限制，降低或者不使用DMSO，寻找其它替代物是比较好选择。
2、血清，即使是纯化得到的白蛋白，由于其动物来源的特性，会极大增加带来病毒等感染物质的可能。而且，血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂也显得尤为必要。
3、目前，成熟和稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。细胞储存在-196℃液氮中，理论上储存时间是无限的，但是液氮冻存步骤繁琐，需要经过程序降温，如先将冷冻管置于4℃冰箱10分钟，然后移至-20℃冰箱30分钟，再移至-80℃冰箱保存16-18个小时(或隔夜)，最后才移至液氮罐中进行长期的储存。(其中需要注意的是-20℃条件下不可超过1个小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量的死亡。)

 

赛尔瑞成科学家团队在细胞冻存领域进行了大量研究工作，分别于2015年研发了 “Cellregen无血清细胞冻存液”（货号：CF0101） 和2020年研发了 “无血清低DMSO细胞冻存液”（货号：CF0201；申请号：202010307890.6）。这两款冻存液均是不含血清，含DMSO，非程序降温、可-80℃长期冷冻保存的通用型细胞冻存液 ，区别在于“Cellregen无血清细胞冻存液”(货号：CF0101)的DMSO含量为10%， “无血清低DMSO细胞冻存液”(货号：CF0201)DMSO的含量为5%(与传统细胞冻存液的对比可参考附表) ，产品均获得了广大科研工作者的喜爱。

“Cellregen无血清细胞冻存液”（货号：CF0101）链接

“无血清低DMSO细胞冻存液”（货号：CF0201）链接

 

 

鉴于某些类型的细胞对DMSO敏感，使用含DMSO的细胞冻存液可能会影响细胞的功能，赛尔瑞成继续研究工作，开发出一款无血清、无DMSO、无毒性、非程序降温、-80℃可长期冷冻保存的冻存液体系：CRD0无血清无DMSO细胞冻存液（货号：CF0301）。

 

产品特点：

☆  高安全性，不含血清及动物源成分，病毒、霉菌和支原体等污染可能性低，各批产品之间有更高的产品质量一致性。

☆  无DMSO，对细胞无潜在的毒性作用。

☆   细胞存活率高，无批次差异。

☆  *冻存液配方，可直接使用，方便简捷。

☆  可直接存放于-80℃冰箱冻存，无需经过费时的程序降温过程(省时、省力、省钱)，不需要采用程序降温仪，更不需要放置在-196℃液氮。

☆  可原位冻存，比如杂交瘤细胞的亚克隆，可以大规模减少工作量，避免污染。

 

CRD0无血清无DMSO细胞冻存液冻存效果：
 

图1. 3T3细胞复苏后细胞状态图                                

 

 

           3T3细胞存活率>90%   

 

图2. ATDC5细胞复苏后细胞状态图

        

 

 

          ATDC5存活率>90%

 

图3 小鼠脾脏T细胞复苏后细胞凋亡图   

 

 

 三个批次复苏率均>95%，且批次间冻存效果无明显差异

附表：通用细胞冻存液，CRD10无血清细胞冻存液、CRD5无血清低DMSO细胞冻存液，CRD0无血清无DMSO细胞冻存液的比较

	通用细胞冻存液	CRD10无血清 细胞冻存液	CRD5无血清低DMSO 细胞冻存液	CRD0无血清无DMSO 细胞冻存液
主要成份	含血清， 含DMSO	不含血清， 含 DMSO 10%	不含血清， 低DMSO 5%	不含血清， 不含DMSO
细胞毒性	高	高	低	无
安全性	低 动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险偏高	高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险	高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险	高 无动物来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险
冻存细胞种类	适合含血清细胞冻存	通用型 适合各类细胞冻存	通用型 适合各类细胞冻存	通用型 适合各类细胞冻存
无血清培养细胞生长状态	易改变易由悬浮状态回复贴壁状态	保持悬浮培养状态	保持悬浮培养状态	保持悬浮培养状态
批次差异	批次差异大	无批次差异	无批次差异	无批次差异
操作方法	步骤繁琐 需程序降温冻存	简单快捷 一步冻存-80℃冰箱	简单快捷 一步冻存-80℃冰箱	简单快捷 一步冻存-80℃冰箱
保存设备	要求高（液氮）	要求低（-80℃冰箱）	要求低（-80℃冰箱）	要求低（-80℃冰箱）
微量冻存	细胞易死亡，存活率偏低	细胞存活率高	细胞存活率高	细胞存活率高
原位冻存	不可行	可行，且方便快捷 如: 杂交瘤细胞孔板冻存	可行，且方便快捷 如: 杂交瘤细胞孔板冻存	可行，且方便快捷 如: 杂交瘤细胞孔板冻存