兔皮脂腺原代细胞

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细胞属性：

方法简介

实验室分离的兔皮脂腺采用蛋白酶联合机械分离制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的兔皮脂腺经CK4免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

细胞简介：

兔皮脂腺细胞分离自皮脂腺组织；皮脂腺是由腺泡与短的导管构成的全浆分泌腺，皮脂腺导管开口于毛囊。除手外的其余部位皮肤中均有皮脂腺，前额、鼻、背上部的皮脂腺多，称为皮脂溢出部位。其余的部位比较少，掌、足趾及足背没有皮脂腺。皮脂腺大多位于毛囊及立毛肌之间，由一个或几个囊状的腺泡与一个共同的短导管构成。分泌部呈囊泡状，由多层腺细胞构成。腺泡周边紧贴基膜的细胞较小，呈扁平或立方形，称为基细胞。新生的腺细胞不断向中心移动，体积增加，胞质内的小脂滴越来越多，腺泡中心的细胞更大，细胞核固缩、细胞器消失，胞质内充满脂滴。后腺细胞解体并与脂滴同时排出，即为皮脂。皮脂腺的分泌因人种、年龄、性别及气候等因素而不同。10岁以前分泌力弱，16～35岁分泌旺盛，老年期减弱；夏天分泌旺盛，秋冬季分泌较少；过食油腻、辛辣刺激的食物以及按摩也可增加分泌。皮脂腺分泌旺盛，可导致皮肤油腻、皮肤粗糙、毛孔粗大，容易发生粉刺及脂溢性皮炎。皮脂腺，分泌皮脂过少，可导致皮肤干燥、脱屑、皮肤老化等，所以控制皮脂腺的分泌很关键。皮脂腺的活动也与多种皮肤疾病相关，例如: 皮脂腺数量或其活动的减少可能会导致皮肤干燥综合征，特应性皮炎是皮肤屏障功能障碍的炎症性疾病，研究发现其发病与皮脂腺功能减弱有关 ，毛周角化病的皮损中则没有皮脂腺。而皮脂分泌过多和寻常痤疮相关。同时现有研究分析结构化数据特征， 尝试探索皮脂腺与皮脂腺肿瘤发生的联系。

培养信息：

包被条件：鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基：基础培养基，含FBS、EGF、Hydrocortisone、肾上腺素、甲状腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

兔皮脂腺细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

操作步骤：

1.将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞长至80%时取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室温孵育爬片20min，使细胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min（一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢），PBS冲洗3次，每次3min。

5. 封闭血清室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min。

6. 细胞特异性一抗孵育：按照抗体说明书稀释比例稀释好一抗，滴加在爬片上，于4°C湿盒中孵育一夜，PBS冲洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：选与一抗对应的二抗，按比例稀释后滴加在爬片上，37°C湿盒中孵育30min，PBS冲洗3次，每次3min。

8. 将爬片周围水渍吸干，爬片上滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，当出现棕黄色或棕褐色的阳性信号时用蒸馏水冲洗终止显色。

9. 复染：用Harris苏木素复染30s~1min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用蒸馏水（或PBS）水洗返蓝。

10. 封片：将中性树胶滴在爬片一侧，再用盖玻片盖上，先放平盖玻片一侧再轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的爬片平放置于通风厨中晾干。

11. 镜检观察。

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