兔脑微血管内皮原代细胞

兔脑微血管内皮原代细胞

兔脑微血管内皮细胞分离自脑组织；脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，它是组成脑微血管腔面单层扁平上皮样细胞，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑，大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在脑血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。其主要特征如下：①脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；②脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；③脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化"的表现型。

产品名称：兔脑微血管内皮细胞

组织来源：脑

产品规格：5×10⁵Cells/T25培养瓶

包被条件：PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

兔脑微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

方法简介

实验室分离的兔脑微血管内皮采用胶原酶-蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的兔脑微血管内皮经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；

1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。