大鼠阴道上皮原代细胞

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细胞属性：

方法简介

公司实验室分离的大鼠阴道上皮采用-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的大鼠阴道上皮经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

细胞简介：

大鼠阴道上皮细胞分离自阴道组织；阴道位于膀胱、尿道和直肠之间，是一个富有弹性的管状器官。它在人类生殖过程中具有多种生理功能，是连接子宫与外阴的通道，是排出月经血、娩出婴儿的必经之路，也是一个重要的性交器官。阴道壁按组织学由外到内分三层，即黏膜层、肌层和外膜，阴道黏膜是外层，也就是浅表的那一层，相当于皮肤的外面层一样。阴道上皮呈粉红色，表面为复层鳞状上皮，但无角化层。在正常的月经周期中，阴道上皮脱落的上皮细胞的形态随着卵巢内分泌的变化而改变，因此通过阴道脱落上皮的病理检查便可以初步判断卵巢的内分泌功能状况。阴道粘膜是指阴道内壁分泌的保持阴道内壁表面湿润，保持表面活力的粘液膜层，因为其表面多粘稠，故为粘膜。在卵泡期，阴道粘膜受雌激素作用，上皮增厚，表皮细胞角化；阴道上皮细胞内糖原丰富（注：阴道粘膜上皮是复层扁平上皮又名“复层鳞状上皮"），在阴道杆菌作用下分解为乳酸，保持阴道的酸性环境；排卵后，受孕激素作用，阴道粘膜上皮大量脱落，角化现象消失。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

公司产品：

操作步骤：

1.将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片，待细胞长至80%时取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室温孵育爬片20min，使细胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min（一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢），PBS冲洗3次，每次3min。

5. 封闭血清室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min。

6. 细胞特异性一抗孵育：按照抗体说明书稀释比例稀释好一抗，滴加在爬片上，于4°C湿盒中孵育一夜，PBS冲洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：选与一抗对应的二抗，按比例稀释后滴加在爬片上，37°C湿盒中孵育30min，PBS冲洗3次，每次3min。

8. 将爬片周围水渍吸干，爬片上滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，当出现棕黄色或棕褐色的阳性信号时用蒸馏水冲洗终止显色。

9. 复染：用Harris苏木素复染30s~1min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用蒸馏水（或PBS）水洗返蓝。

10. 封片：将中性树胶滴在爬片一侧，再用盖玻片盖上，先放平盖玻片一侧再轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的爬片平放置于通风厨中晾干。

11. 镜检观察。