酶ⅠNAD(H)可见分光光度法

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测定意义

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品：液体×1支（EP管中），2 μmol/mL酚标准液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。

2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

Cerberus蛋白(CER)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Cerberus (CER)    96T    Mus musculus (Mouse)

HtrA酸肽酶4(HTRA4)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for HtrA Serine Peptidase 4 (HTRA4)    96T    Homo sapiens (Human)

红细胞生成素(EPO)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Erythropoietin (EPO)    96T    Rattus norvegicus (Rat)

胞外超氧化物歧化酶(SOD3)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Superoxide Dismutase 3, Extracellular (SOD3)    96T    Mus musculus (Mouse)

组蛋白H4(H4)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Histone H4 (H4)    96T    Mus musculus (Mouse)

半乳糖凝集素9(GAL9)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Galectin 9 (GAL9)    96T    Homo sapiens (Human)

补体成分5a(C5a)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Complement Component 5a (C5a)    96T    Rattus norvegicus (Rat)

雌激素受体β(ERβ)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Estrogen Receptor Beta (ERb)    96T    Homo sapiens (Human)

氨基端前脑钠素(NT-ProBNP)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for N-Terminal Pro Brain Natriuretic Peptide (NT-ProBNP)    96T    Canis familiaris; Canine (Dog)

Ⅰ型前胶原羧基端原肽(PⅠCP)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Procollagen I C-Terminal Propeptide (PICP)    96T    Homo sapiens (Human)

血小板反应蛋白(THBS1)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Thrombospondin 1 (THBS1)    96T    Mus musculus (Mouse)

分泌型免疫球蛋白A(sIgA)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Secretory Immunoglobulin A (sIgA)    96T    Bos taurus; Bovine (Cattle)

转甲状腺素蛋白(TTR)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Transthyretin (TTR)    96T    Homo sapiens (Human)

生长分化因子11(GDF11)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Growth Differentiation Factor 11 (GDF11)    96T    Homo sapiens (Human)

C4结合蛋白β(C4BPβ)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for C4 Binding Protein Beta (C4BPb)    96T    Homo sapiens (Human)

补体因子P(CFP)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Complement Factor P (CFP)    96T    Homo sapiens (Human)

生长分化因子11(GDF11)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Growth Differentiation Factor 11 (GDF11)    96T    Mus musculus (Mouse)

核因子κB受体激活因子配基(RANκL)检测试剂盒(化学发光免疫分析法)    CLIA Kit for Receptor Activator Of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANkL)    96T    Rattus norvegicus (Rat)

Tetracycline/OVA  四环素偶联鸡卵白蛋白     2mg

Oxytetracycline/BSA  土素偶联牛血清白蛋白     2mg

Oxytetracycline/OVA  土霉偶联鸡卵白蛋白     2mg

streptomycin/OVA  链素偶联血蓝蛋白     5mg

Penicillin G/BSA  青G偶联牛血清白蛋白     2mg

Penicillin G/OVA  青霉素G偶联鸡卵白蛋白     2mg

酶ⅠNAD(H)可见分光光度法streptomycin/BSA  链素偶联牛血清白蛋白     2mg

streptomycin/OVA  链霉偶联鸡卵白蛋白     10mg

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 对照管：取EP管，加入4μL上清液，40μL蒸馏水，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。

6. 测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。

其中标准管和空白管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。

注意：空白管和标准管只需测定一次。