曼那角病毒PCR检测试剂盒

组成及试剂配制:

1、酶标板：一块（96孔）

2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3、 样品稀释液：1×20ml。

4、 检测稀释液A：1×10ml。

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注意事项：

1.整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2.为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3.每次实验应该设置阴、阳性对照。

4.试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。

5.试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。

6.为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

7.仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。

8.ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。

9.实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。

PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

实验外包:

1.基因组学：基因芯片、SNP检测、DNA甲基化检测、生物信息学分析

2.转录组学：microRNA芯片、LncRNA芯片、表达谱芯片、RNA-seq

3.蛋白质组学：2D-DIGE、SILAC、iTRAQ、TMT、Label-free、MRM

4.基因检测：DNA/RNA提取、RT-PCR、Real-timePCR

5.蛋白质检测：Western blot、Co-ip  EMSA、CHIP、免疫荧光、ELISA

6.病理检测：HE染色、特殊染色、组织切片、免疫组化、流式细胞分选

7.代谢组学：GC-MS、LC-MS、NMR

8.细胞及动物模型：原代细胞、细胞模型、动物模型构建

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