大鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）Elisa试剂盒

大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)Elisa试剂盒是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

规格：48T   96T

检 测 范 围 ：7pg/ml-220pg/ml
使 用 目 的 ：本试剂盒用于测定山羊血清、血浆及相关液体样本中小反刍兽疫抗体(PPRAb)含量。

标 本 要 求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)Elisa试剂盒试剂及试剂配制
 1. 抗原及酶标记抗体 
①抗原： IgG 
②酶标抗抗体：羊抗鼠IgG-HRP 
2.包被液（CBS）：Na2CO3   0.8g，NaHCO3  1.46g，水溶解，定容500ml。  
3. 封闭液（3％BSA+CBS 或5％牛奶+CBS）：含3％牛血清白蛋白（BSA）：10mL CBS中加入0.3g BSA。含5％荷兰牛奶：10mL CBS中加入0.5g牛奶 。 
4. 洗涤液（PBST 10*）：KH2PO4   4g，Na2HPO4·12H2O    58g，NaCl   160g， KCl  4g，Tween-20 10mL  加水定容2L。  
5. 洗涤液(1*PBS)： PBST：H2O=1：9 
6. 底物溶液（4甲基酰苯氨） ①TMB底物缓冲液(0.005mol/LPH3.6醋酸钠-柠檬酸缓冲液)：称NaAc·3H2O：1.13g，C6H8O7·H2O ：1.05g，用蒸馏水溶解，定容至1000mL，调PH=3.6。 ② TMB底物液：称3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）0.08g 溶于40mL 二甲基亚砜（DMSO）中，加60 mL 甲醇，混匀，加100mL 底物缓冲液，在暗处避光搅拌2小时至溶解，4℃避光保存。 ③H2O2 底物液：取140μL过氧化氢（H2O2）加入200mL底物缓冲液混匀。 ④底物应用液：现用现配，TMB:H2O2=1:1混匀。 
7. 终止液：2mol/L H2SO4 

大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)Elisa试剂盒操作步骤
 ①抗原包被过夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。 抗原用量：0.1μg*100N/抗原浓度 （N为板数）
②封闭：弃上清 加300μL/孔封闭液，37℃放置2h。 
③洗涤：用洗涤液洗3次 
④加一抗(待测样品为细胞培养上清)：将含单克降抗体的细胞培养上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培养基作为阴性对照，已知样品血清（1：200稀释于1%BSA+PBST中）作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。 测免疫效价待测样品为小鼠血清时：采小鼠血液于常温20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min离心。将含抗体的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST连续倍比稀释(按照1：200开始)，100μL /孔。每个样品平行做两份，小鼠阴性血清或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。37℃恒温箱温育2h。 
⑤洗涤：用洗涤液洗5次。 
⑥加二抗（酶标抗抗体）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀释，100μL／孔， 37℃恒温箱温育1h。
⑦洗涤：用洗涤液洗5次， 
⑧显色：加新鲜配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒温箱放置10min，显示蓝色。 
⑨终止反应、比色：加30μL/孔H2SO4终止液．颜色变黄；用酶标仪测定450nm  630nm处各孔的吸光值，阳性反应的zui大稀释度为待测样品的效价。

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