实验方法原理

取材于出生2~3 d 小鼠颅骨，以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，采用胶原酶消化法分离成骨细胞，并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。

实验材料SD大鼠

试剂、试剂盒F12 *培养液胰蛋白酶Ⅱ型胶原酶酒精

仪器、耗材手术器械磁力搅拌器

实验步骤

一、实验步骤

1.  拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12 *培基液的培养皿中再洗涤， 将颅骨剪成2～5 mm2 碎片，将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。

2.  然后以0.1%  Ⅱ型胶原酶10 ml，在37℃环境中消化 20 分钟，室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞，接种于75 ml 培养瓶中，补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟，将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5% CO2，95%空气，37℃温度下培养，24 小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化 1 遍)。

3.  原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶，弃去培养 液，传代时先以 PBS 冲洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室温下消化3～5 分钟，将胰蛋白酶液弃去，加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用 F12 *培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多，细胞老化或者分化明显。

二、结果

如图所示，成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似，但是不同的是，比成纤维细胞更不容易消化，尤 其是传代次数多，细胞老化的时候，非常难消化，并且不易消化成单个细胞。

图1：成骨细胞

图2：成骨细胞100倍
 

图3：成骨细胞形成的矿化结节

三、鉴定的方法

1.  碱性磷酸酶(ALP)活性检测

2.  骨玻璃样蛋白(BGP)检测

3.  矿化结节检测

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注意事项

1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。

4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。

5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。

8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

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其他

一、讨论

成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，可采用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、 骨髓培养法以及薄层骨片经 EDTA 处理并经胶原酶消化，均可培养出成骨细胞。体外培养的成骨细胞保持 有骨组织细胞的某些特征。据文献报道，不同方法培养的成骨细胞形态是不同的[1]。

二、文献

[1]  司徒镇强. 细胞培养 [M]. 版. 西安. 世界图书出版社西安公司, 2000:115.