实验原理

MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。故通过反应细胞形成的MTT-甲肷量，即可测定IL-1对L929细胞促增殖作用程度，从而间接测定IL-1的生物活性。
实验试剂

1. 0.25%胰蛋白酶
2. 10%FCS-RPMI-1640*培养液
3. MTT：用PBS稀释成5mg/ml，用0.22μm膜过滤除菌及杂质，4℃避光保存。
4. 酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl的异丙醇)：100ml异丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。
实验设备

96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)，刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，5%CO2培养箱，超净工作台，酶标测定仪，570nm与630nm滤光片。
实验材料

1. 已诱生的IL-1待检样品：倍比稀释成不同浓度。
2. IL-1标准品：倍比稀释成不同浓度。
3. L929细胞：作为反应细胞或靶细胞，存活率应>95%。
实验步骤

1. 将生长状况良好的L929细胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min；
2. 将L929细胞用10%FCS-RPMI-1640培养液洗涤2次，以去除消化液及原生长培养液；
3. 用10% FCS-RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；
4. 将L929细胞悬液加至96孔细胞培养板，100μl/孔；
5. 分别加入不同倍比稀释度的IL-1标准品和待测样品于96孔细胞培养板中，100μl/孔，各设3个复孔，同时设立培养液空白对照；
6. 置37℃，5% CO2培养箱中培养56h；
7. 将96孔培养板取出，各孔加入MTT，10μl/孔；
8. 置37℃，5% CO2培养箱中继续培养4h；
9. 取出培养板，先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去，再加入酸化异丙醇或DMSO，100μl/孔，置室温10~20min，吹打震荡，充分混匀，使MTT-甲肷产物充分溶解；
10. 用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm，分别测定各孔OD值。测定应在酸化异丙醇加入后lh内完成。
注意事项

1. L929细胞存活率应>95%，L929细胞在培养条件不良时，可呈圆形漂浮状，此时更换培养液可使其恢复为正常的梭形贴壁细胞。
2. 应充分洗涤后加入培养板中，且应均匀分散于各孔中，否则可能造成某个部位细胞过密而某个部位细胞过稀，影响细胞单层形成。
3. 标准品及待测样品应从1:2开始至少6个倍比稀释度。
4. 加样时，应从低浓度到高浓度顺序加入，不可共用加样器头。
5. 加入酸化异丙醇后，应在lh内进行OD值测定。
6. 还可按正态概率纸法或概率单位法计算IL-1的活性单位。