质粒载体提取试剂盒

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中文名：质粒载体提取试剂盒

品牌：Omega

供应商：上海古朵

用途：提取质粒DNA

基本原理：碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒, 是每个分子生物学实验室都要用到的常规技术

质粒提取方法：碱裂解法，煮沸法，去污剂裂解法

详细介绍：

质粒提取原理：

现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。

碱裂解法是一种zui广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远远大于质粒DNA，染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完全变性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象，在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。

质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用:
溶液1（P1）
组分浓度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖（Glucose）
溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。

溶液2（P2）
组份浓度 250 mM NaOH，1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）
溶液2的主要作用是细胞裂解。

溶液3（N3）
组份浓度 3M 醋酸钾（potassium acetate），5M 醋酸
溶液3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除掉蛋白质等细胞内的杂质。

溶液PE （wash buffer）
组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）， 80 % 乙醇（Ethanol）
Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的盐离子。试剂盒中都是利用硅胶柱进行DNA提取的。

溶液EB（Elution buffer）
组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）
EB的作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

质粒提取试剂盒操作步骤：

1.用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min，弃上清。

应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2.加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。

初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于 4℃保存。可保存6 个月。

不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA 得率的高低。

室温静置1-2 min 是为使溶液中的RNA 被充分降解。

3.加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA 的纯化结果。

不可剧烈混和，否则会使染色体DNA 断裂。

此步骤不宜超过5 min。

4.加入350 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5.12,000 rpm 室温离心10 min，收集上清。

6.将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。

如果收集的上清液过多，超过DNA 纯化柱容积（800 μl），可将上清分次加入DNA 纯化柱中。

7.12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

此时质粒DNA 被吸附于DNA 纯化柱的硅胶膜上。

8.加入500 μl 溶液PB，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9.加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

溶液W 初次使用前用无水乙醇按1: 1.5 稀释，即含60%乙醇。

10.加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。

11.12,000 rpm 离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12.将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100 μl 溶液Eluent，室温放置2 min。

12,000 rpm离心1 min， 管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA 于-20℃保存

溶液 Eluent 可用无菌双蒸水代替，但其pH 需为8.0-8.5。溶液Eluent 的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

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