Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

产品描述
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒为Annexin V与PI联合使用的试剂盒，用于检测细胞凋亡早期的发生，可区分凋亡早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。
Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝*酸(PS)结合。PS正常分布在细胞膜内侧。PS外翻到细胞膜外是不同类型的细胞在凋亡早期的明显特征，用带有FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到这一重要特征。FITC呈现黄绿色荧光。
PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶）是一种可对 DNA 染色的细胞核染色试剂，在嵌入DNA 后释放红色荧光。PI不能穿透完整的细胞膜，但可以穿透坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。
Annexin V-FITC与PI联合使用时，PI 被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
FITC最大吸收波长和激发波长分别为494nm和518 nm，PI-DNA复合物的最大吸收和发射波长分别为535 nm和617 nm。
订购信息

产品组分

运输与保存
蓝冰运输。4℃避光保存，有效期18个月。【注】：不可冷冻。
使用方法
下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例，如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞，实验条件需要略作调整。
1.流式细胞检测

1. 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，建议设定一组样品做（Annexin V-FITC或PI）单染，用于调节补偿。

2. 收集细胞。

悬浮细胞：300 g，4℃离心 5 min 收集细胞；
贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰*消化后 300 g，4℃离心 5 min收集细胞，胰*消化时间不宜过长，以防引起假阳性。【注】：用胰蛋*酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约30 min，然后再染色。胰*白酶消化会暂时破坏质膜，允许Annexin V-FITC结合磷脂酰丝*酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。

3. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，每次均在 300 g，4℃ 下离心 5 min，收集 1-5×10⁵ 个细胞并用 100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞。

4. 每管加入 4-5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI工作液。【注】：推荐准备两管额外的流式管，每管只加入一种单染染料（Annexin V-FITC或PI），用于流式单染的补偿调节。

5. 室温避光孵育 10-15 min，为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作。

6. 每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Annexin V-FITC 可以由 488nm 激光激发，检测荧光发射光谱约在 530 nm 处（FITC 通道），PI 通道发射光谱约在 617 nm 处。【注】：PBS 或 1×结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择。

2.荧光显微镜检测
对于悬浮细胞，可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。

1. 在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。

2. 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。

3. 用 PBS 洗涤细胞。【注】：细胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培养基直接替代Annexin V 结合缓冲液，但是 Annexin V 的使用浓度需要重新优化。

4. 每 100 μL 的 Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI。【注】：最佳使用浓度由具体实验要求确定。

5. 向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞，室温避光孵育 15-30 min。为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至 30 min。

6. 用 1×结合缓冲液清洗细胞。

7. 将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上，载玻片可提前加一滴 1×结合缓冲液；对于培养在小室内的细胞，可直接加入足量的 1×结合缓冲液覆盖细胞。

8. 使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察细胞。Annexin V-FITC 可用 FITC 适用的滤光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事项

1. 本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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