Quick Cell 外泌体提取试剂盒

产品描述
   外泌体是由细胞分泌的包含RNA和蛋白质的小囊泡（20-200 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能，在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子；然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。
 外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。李记生物自主开发的外泌体快速提取试剂盒，组分经过优化处理，适用于细胞培养上清液、血清、血浆、尿液及其他体液（脑脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等）中的外泌体提取，并搭配纯化过滤装置，可快速地获得高纯度外泌体颗粒。
本试剂盒处理单位样品成本仅为国外同类产品的1/6-1/3，经上海市计量测试技术研究院检测，本试剂盒与国外产品提取纯化相同样品所得的外泌体，没有显著差异。
试剂盒组成

       *RNase/DNase Free, Sterile

运输与保存条件

常温运输，室温条件下质保期24个月，使用前充分混匀。

使用方法

1.条件准备 

①高速离心机(可达10000g离心力)；2mL、50mL(或15mL)离心转子；1.5mL，50mL(或15mL)离心管；② 1×PBS缓冲液。

2.样品预处理

①样品准备：如果是冻存样品，从冰箱取出后于25℃水浴中进行解冻，将*融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

②离心去除细胞碎片，将样品转移至离心管中，在4℃，3000 g条件下离心10 min，取上清转移到新离心管中。

③离心去除其他杂质，*次离心收集的上清液，在4℃，10000 g条件下离心20 min，取离心上清液转移到新的离心管中备用。

注：本试剂盒盒可处理多种样品，处理量因样品种类不同而有差异。单次提取可处理的不同样品量范围见下表。

表1.单次提取可以处理的不同样品量的范围（单位：mL)

3.提取外泌体

①上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS试剂）；部分粘稠的样品（血清、血浆、乳液、唾液等）需先加入预冷的与样品等体积的1×PBS进行稀释，之后再加入ECS试剂，试剂用量如下表，表中样品为举例值，其他剂量样品根据表中的试剂用量等比例调整。

表2.外泌体提取试剂用量表（单位：mL）

②溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，上下颠倒离心管10-20次，再放置于2℃至8℃静置过夜（10 h-12 h）；

③沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）

④外泌体重悬：取400μL 1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其均匀悬浮在PBS中后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中；

⑤收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。

4.纯化外泌体

①纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosomoe Purification Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；

②外泌体的保存：纯化后的外泌体以50 -100μL进行分装，分装后的外泌体保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

常见问题

Q1：粘度大的待测样本如何处理？

A1：待测样品粘度过大时，可将样本用4℃预冷的1×PBS缓冲液进行等体积稀释处理。

Q2：收获的外泌体颗粒无法通过EPF柱纯化时怎么处理？

A2：由血清、血浆、唾液等样品收获的外泌体浓度较高，此时可用4℃预冷的     1×PBS进行稀释后再通过EPF柱离心。

Q3: 外泌体如何保存？

A3：纯化完成后的外泌体可50 μL-100 μL分装后保存于-80℃备用。

Q4：如何鉴定提取的外泌体？

A4：针对外泌体标志蛋白（CD63, CD9, CD81等）进行Western blot检测鉴定所提的外泌体Q5：培养细胞时，血清来源的外泌体怎么去除？

A5：多数情况下，细胞在体外培养需要血清，但血清中含有外泌体，为了避免血清污染细胞产生的外泌体，一般采用2种方法：

①细胞培养前，通过100000×g超速离心过夜，去除血清外泌体。

②可选择无血清培养基进行培养。

Q6：细胞培养过程中死细胞是否会影响外泌体的提取？

A6：会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，细胞zui终会裂成碎片，它们在外泌体的纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体。

应用案例

1、外泌体电镜检测：

    本试剂盒提取纯化的PC-12细胞培养上清液中的外泌体颗粒，通过透射电镜（TEM）检测的结果：

从电镜照片中可观察到100 nm左右、具有清晰的膜的茶托样结构，符合外泌体的结构特性（scale bar=100 nm）。

2、外泌体粒径检测：

    本试剂盒提取纯化的PC-12细胞培养上清液中的外泌体颗粒，通过美国PPS公司（Particle Sizing Systems） Nicomp 380 Z3000粒度仪检测的结果：

从粒径检测结果来看，纳米颗粒主要分布在10-100nM之间，和预期的外泌体颗粒大小基本吻合（横坐标单位为 nM）。

3、Western blot及qPCR检测：

上图为本试剂盒提取的MCF-7及MHCC97H细胞培养上清液中外泌体膜蛋白CD63的western blot（A）和miRNA qPCR（B）检测结果。

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