天木生物ARTP与MMC成功助力灵芝菌株的高通量选育

本期为您推荐上海市农业科学院张劲松研究员团队近期公开的一份发明专利：一种灵芝菌株的高通量选育方法。该研究利用室温常压等离子体诱变仪（ARTP），构建大规模诱变库，结合微液滴培养技术（MMC）进行高通量筛选，筛选到三个灵芝菌株，通过摇瓶传代5次发现三个灵芝诱变株的遗传性状稳定，可应用于灵芝产业中的生产和研究。

灵芝(Ganoderma lucidum)是一种重要的药用真菌，具有多种药用功效，如免疫调节、抗肿瘤等。近年来，随着人们对健康食品和保健品的需求增加，灵芝及其相关产品的市场需求也日益增长。然而，灵芝的生长速度和产量较低，限制了其应用及产业化的发展。目前，常见的灵芝菌株选育方法主要是利用化学诱变法和物理诱变法。化学诱变法会带来较高的毒性和突变率，可能存在味道不好和生物安全问题。而物理诱变法在保证品质稳定和生物安全的同时，也能产生大量变异体。

近年来，ARTP诱变技术在在生物育种中有着广泛的应用，该技术具有诱变效率高、操作简便、突变范围广、不影响基因组整体稳定性等优点。MMC技术则是一种高通量微量培养技术，通过使用微小培养箱和液面控制器，将大量菌株同时在微小体积内培养，从而减小了单个菌株生长过程中的扰动，并可同时研究多个菌株在不同环境下的代谢活性。结合使用ARTP和MMC技术，可以实现对微生物菌株的快速、高效的选育，从而提高菌株的产量、适应性和其他优良性状，为灵芝的高通量筛选提供了技术基础。

本研究中，研究团队首先对灵芝菌株G0023活化并制备原生质体，利用ARTP IIS对原生质体进行诱变，计算致死率（图1）。当致死率达到90％的时候所设置的参数作为后期处理的最佳处理参数。针对诱变后的原生质体，利用MMC系统(微生物液滴培养仪)进一步筛选，选育灵芝G0023诱变菌株。对野生菌株与诱变筛选后的菌株进行平板与摇瓶水平进行比较，分析其生长性能，葡萄糖的利用与三萜的产量，并对诱变菌株进行传代，验证其遗传稳定性。

利用平板的菌落半径从诱变库中筛选出3株菌株（表1），摇瓶中发酵并测定诱变菌株对底物葡萄糖利用率，菌丝体干重，菌丝体中三萜产量。结果显示4个菌株在发酵7天后，培养基中葡萄糖的利用率都处于较高水平（图2），其中2株菌的菌丝干重较野生型提高26.33％和17.85％。这两株菌的三萜产量提高了32.10％和15.72％（图3）。三个菌株摇瓶传代5次后对其生长情况进行分析发现，各诱变株遗传稳定性较好（图4）。这些结果显示用ARTP诱变技术和MMC高通量筛选技术相结合，可以从灵芝菌株中高效筛选出生长速度快、产物含量丰富的优良菌株。

图1 灵芝G0023原生质体致死率曲线

表1 三个诱变菌株与G0023在平板生长速度

图2 G0023与诱变菌株摇瓶发酵情况

图3 G0023与诱变菌株菌丝体总三萜产量

图4 三个诱变菌株遗传稳定性分析

专利链接：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ncFPfL1MdGantM7otBUhBk09fLtzk8_Ui7z3pxaUk4oNqCgtNABqXpt5c6hEFt72SzwbhpvD5SqZFlup6oXeGY-xBVatmwLl7hRoUFrH3hWWVBZjWgpI5zY_YZ0WfF0EbXNiNR7dHNY=&uniplatform=NZKPT