实验共分以下4个主要步骤:

1.细胞铺盘

HeLa S3细胞，密度为80%左右分盘，使铺盘密度在50%左右， 为满足流式细胞仪上机要求，细胞数目需大于1x10组。2.细胞同步化处理:

a)加入终浓度2mM的Thymidine同步化18h

b)用温育的PBS洗4次，更换新鲜培养基，培养9h

c)再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.样品收集;

a)分别收取释放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細胞样品

b)每个样品收取都使用预冷的PBS洗涤4次，1000g离心5min, 弃上清

c) 100uL PBS重悬沉淀，吸取出细胞悬液于移液器中，于移去细胞的管中加入900μl预冷的70%乙醇，旋涡振荡器震荡中滴入细胞悬液。

d) 4C固定一小时或更 长时间。

e) 1500rmp，离心10min,去固定液。

f)细胞染色液配制: 50xRNase A母液: 50xPI母液: PBS=20: 20: 960; RNase A母液浓度1mg/mL，工作浓度20μg/mL; PI母液浓度2.5mg/mL, 工作浓度50μg/mL 。

g)细胞37度染色1h。根据细胞童，加入一定体积的细胞染色液(1~1.5mL) 重悬，使上机时细胞通过率为

200~350Cl/s，,染色液不可过多或过少，过多则细胞密度过低上机速度严重不足，过少则导致细胞粘结。

h) 300目筛网过滤至流式管中。

4.上机检测;

流式细胞仪上机检测，计数50000个细胞。

5.同步化数据分析

数据使用ModFit软件分析。