50次-汉坦病毒通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒_PCR-染料法-上海信裕生物科技有限公司

供货周期	一周	规格	50T
货号	XY-0336	应用领域	医疗卫生,环保,化工,生物产业,农林牧渔
主要用途	荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。

汉坦病毒通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Hantavirus(HV)

产品及特点

汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链 RNA 病毒，基因组包括 L、M、S 3 个片段，分别编码 L 聚合酶蛋白、G1 和 G2 糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒可两种：引起汉坦病毒肺综合征（HPS），另一种引起汉坦病毒肾综合征出血热（HFRS）。前者主要流行于美国，在阿根廷、巴西、巴拉圭、玻利维亚以及德国也发现了病例。中国虽未发现，但有发生的可能。因此汉坦病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发，专门检测汉坦病毒的通用试剂盒。它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据汉坦病毒保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

汉坦病毒通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号	成份	规格
试剂一	2×qRT-PCR 缓冲液	500 μL（棕色管）
试剂二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（红盖）
试剂三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
试剂四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
试剂五	荧光PCR模板稀释液	1mL（亮黄盖）
试剂六	汉坦病毒通用染料法RT-PCR引物混合液	100 μL（白盖）
试剂七	汉坦病毒通用染料法RT-PCR阳性对照（1×10E8拷贝/μL）	50 μL（黄盖）
试剂八	使用手册	1份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA段作为阳性对照。

自备试剂 样品RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品 RNA 的制备

6. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

8. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照。 9. 在标记管中按下表加入各成分：

成分	N+2个制备所得样品	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照（2-7管）
2×qRT-PCR 缓冲液	10μL	10μL	各10μL
汉坦病毒通用染料法RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
样品制备所得RNA模板（来于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀释所得6个阳性对照（来于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

10. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

过程	温度	时间
RT（逆转录）	50℃	30 min
预变性	95℃	10 min
RT - PCR 反应（40 个循环）	95℃	15 sec
RT - PCR 反应（40 个循环）	60℃	15 秒（采集FAM通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理
10.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
11.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。