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双歧杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒

Bifidobacterium spp.

产品及特点

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类存在于人体中非常重要的专性厌氧菌，于 1899 年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离，研究证实双歧杆菌具有平衡肠 道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能，是人体益生菌群的主要组成。添加 双歧杆菌的微生态制剂开发研究已成为一大热点，广泛应用于食品、保健和医疗等领域。 但不断有报道指出国内外市场上双歧杆菌微生态制剂标示名称混乱，很多国家市场上双 歧杆菌制品假冒代替现象严重。针对该现象，开发了针对双歧杆菌特异性检测试剂盒， 本产品利用实时荧光定量 PCR 技术，通过荧光染料实时显示样品双歧杆菌模板 DNA 的量, 并通过坐标曲线表示出来, 结果直观准确。它具有下列特点： 

1. 根据双歧杆菌属 tuf 基因，设计的针对双歧杆菌的 PCR 引物，克服了其他细菌的 干扰。

2. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

3. 荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。

4. 本试剂盒可以进行 100 次 20uL 体系的 qPCR 反应。

5. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

双歧杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输、-20℃保存(B 袋的阳性对照一定要放扩增区，A 袋的试剂放样品准备区)，有 效期一年。 

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、样品 DNA 的制备

1. 用自选方法纯化双歧杆菌样品的 DNA，

二、引物的制备（在样品制备室进行）

2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水（加入量见引物试管上 的标签），使得两条引物的浓度均为 10 uM（10pmol/uL）。

三、稀释阳性对照（以 10E3-10E7 这 5 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高， 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成 分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体菌做阳性对照，只 提供可以直接使用的长为 339bp 的 DNA 段作为阳性对照。

3. 标记 5 个离心管，分别为 7，6，5，4，3 号。

4. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）。

5. 先将本试剂盒提供的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照用超纯水 10 倍梯度稀释到 10E8 拷贝/μL。放冰上待用。

6. 在 7 号管中加入 5 μL 10E8 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用

 7. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上 步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

8. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 10E6 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上 步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

9. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 10E5 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上 步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

10. 换枪头，在 3 号管中加入 5 μL 10E4 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上 步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E3 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用

三、设置 PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

11. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管 和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有成分盖上盖子 储存好后后加）：

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化）。 

13. 数据采集 具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时， 大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的大吸收光谱在 500 nm，大发射光 谱在 530 nm。

四、数据处理

14. 以 Tuf 基因序列阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。 再以待测样品浓度的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值计算出样 品 DNA 的浓度。