小鼠胚胎成纤维细胞 atcc标准菌株

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　　 小鼠胚胎成纤维细胞 atcc标准菌株 传代保藏过程：

　　3项下标准菌的复苏为传*代，复壮为第二代。 传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。

定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：

　　（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

　　（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。

　　（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。

　　（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。　

　　（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。

　　（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

　　（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱zui多培养7天。

　　当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。

　　基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。本文对三种基因敲除技术作比较，描述它们的优缺点。

　　基于胚胎干细胞的同源重组技术　　1、优势：成熟、可靠、精细是目前为止*一个可以满足所有要求的打靶技术　　2、局限性：　　A 需要ES细胞，目前只有小鼠有的ES细胞，其它模式动物的ESC还不能实现大规模应用。　　B 周期长、工作量大、费用相对比较高　　3、可提供服务类型：　　A 全基因敲除模式小鼠　　B 条件性基因敲除模式小鼠　　C 先全敲除再条件性敲除模式小鼠　　D 基因敲入模式小鼠

　　E ROSA位点定点转基因　　TALEN技术　　1、优势：基因敲除效率高，速度快，可实现多物种基因敲除

　　2、局限性：　　基因敲入效率较低，多基因敲除困难，系统构建相对复杂，存在脱靶风险

　　3、可提供服务类型：　　A 全基因敲除大/小鼠　　B 全基因敲除细胞系

　　EGE系统　　1、优势：基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，系统构建简单　　2、局限性：　　存在脱靶风险，但通过选择合适的sgRNA可以有效降低脱靶率，In vivo脱靶可通过传代去除.　　3、可提供服务类型：　　A 全基因/条件性基因敲除大/小鼠　　B 全基因/条件性报告基因敲除/敲入大/小鼠　C CRISPR/Cas9粒构建　　D 细胞系敲除/敲入

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　　研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。胎牛血清使用错误或胎牛血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

　　研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

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