样本准备:血清样本采集后,需在 1000×g 的条件下离心 10 分钟,小心分离出血清;血浆样本同样按此离心条件处理,注意不同抗凝剂对实验可能产生的影响,需严格按照要求选择抗凝剂;组织匀浆制备时,将适量组织与匀浆缓冲液按比例混合,使用匀浆器充分研磨,随后以 1000×g 离心 10 分钟,取上清备用;细胞培养上清液则直接以 1000×g 离心 10 分钟,去除细胞碎片等杂质。若样本不立即使用,应分成小份,在 - 20℃或 -80℃环境下保存,防止反复冻融,使用前需在室温下缓慢充分解冻并确保均匀。
试剂准备:从冰箱取出试剂盒后,将所有试剂在室温下平衡 30 - 60 分钟,使试剂温度与室温一致,并充分混匀。按照说明书要求,用蒸馏水将浓缩缓冲液、显色剂等试剂准确稀释成工作液。同时,依据实验所需检测的样本数量,确定反应管或酶标板的使用量,标准品孔和空白孔建议设置复孔,以提高检测结果的准确性与可靠性。
加样:在反应管或酶标板上精确设置标准品孔、空白孔与待测样本孔。向标准品孔中加入适量不同活性浓度的精/氨酸酶标准品溶液,浓度梯度需严格按照试剂盒说明书进行配置;待测样本孔加入适量处理好的样本;空白孔则加入等量的缓冲液替代样本。加样时,务必使用微量加样器,并确保加样量准确,将样本或标准品加于反应管或酶标板孔底部,尽量避免触及管壁或孔壁,加样后轻轻振荡,使液体充分混匀。
反应与显色:向各孔中加入适量的 L - 精/氨酸底物溶液,轻轻混匀后,将反应管或酶标板置于 37℃恒温培养箱中温育一定时间(具体温育时长参照试剂盒说明书),使精/氨酸酶与底物充分反应。温育结束后,向各孔中依次加入适量的显色剂,轻轻振荡混匀,避免产生气泡,在室温下避光显色 15 - 20 分钟。
检测与计算:显色反应结束后,立即使用酶标仪在 540nm 波长处测定各孔的 OD 值。依据标准品的 OD 值绘制标准曲线,通过标准曲线计算出样本中精/氨酸酶的活性。若样本进行过稀释,还需乘以相应的稀释倍数得到实际活性。
试剂盒中的所有试剂在使用前必须充分平衡至室温,避免因温度差异影响检测结果的准确性。同时,试剂使用后应及时放回冰箱冷藏保存,防止试剂变质。
样本采集、处理过程务必严格遵循规范操作,防止样本受到污染或发生溶血、脂血等情况,以免干扰检测结果。如血清样本应避免溶血,红细胞溶解可能释放出影响精/氨酸酶活性检测的物质。
反应过程中的温度、时间以及试剂添加量等条件需严格按照说明书执行,任何偏差都可能导致检测结果出现误差。
加样操作要精准、迅速,尽量缩短各孔之间的加样时间间隔,保证实验条件的一致性。使用加样器时,需定期校准,确保加样量的准确性。
显色反应过程需严格控制时间和避光条件,避免光线直射,以保证显色效果的稳定性。加入显色剂后应尽快进行 OD 值测定,一般建议在规定时间内完成,防止结果出现偏差。
实验过程中使用的所有耗材,如反应管、酶标板、吸头、试管等,应确保无污染且质量可靠,避免对实验结果造成影响。
若对检测结果存在疑问或出现异常情况,应及时检查实验操作过程、试剂状态以及仪器性能等,必要时可重复实验进行验证。