Brilliant Violet特色紫色激光染料 — 让流式更精彩
上海优宁维生物科技有限公司

    BrilliantViolet是一种紫色激光激发的染料，比其他紫色激光激发的染料更加明亮。并且，BrilliantViolet比蓝色和红色激光激发的染料也更明亮，它是BD提供的zui明亮的染料。BrilliantViolet™可被紫色激光器在405nm处激发，是当今市场上由紫色激发器激发的所有染料中亮度zui强、信噪比zui高的荧光材料。因此，它特别适合多色应用，可以更好地弱表达细胞群。

Brilliant Violet包括如下系列荧光素：

下面以Brilliant Violet 421™举例介绍：

1 更明亮的紫色激光染料

     Brilliant Violet 421是由Sirigen根据诺贝尔化学奖而开发的一种聚合染料，用于分辨弱表达细胞群体。这种聚合物技术结合了传统有机染料的易用性与藻红蛋白（PE）的亮度，可被紫色激光激发。Brilliant Violet 421平均比Pacific Blue™明亮10倍，比PE明亮2-3倍（表1，图2）。Brilliant Violet 421适用于配备有紫色激光的BD FACS™系列流式细胞仪，包括BD FACSVerse™流式细胞仪，BD™ LSR细胞分析平台，BD FACSAria™细胞分选平台，以及BD FACSCanto™ II 流式细胞仪。Brilliant Violet 421的zui大发射峰在421nm到448nm，适用于标准BD Horizon™ V450滤光片组合（如450/50nm）（图1）。

表1，染色指数比较

裂解的全血用结合了Brilliant Violet 421，Pacific Blue™，BD Horizon V450，VioBlue®或PE的CD4，CD8，CD127染色，在BD LSRFortessaTM流式细胞仪上分析，选取浓度都为*浓度。对淋巴细胞进行圈门。

图1，吸收和发射光谱

zui大激发：407nm，zui大发射：421和448nm

图2，Brilliant Violet 421，Pacific Blue™，BD Horizon V450，VioBlue® 和PE的染色比较

CD4: 裂解的全血用人CD4结合Brilliant Violet 421，Pacific Blue™，VioBlue®，BD Horizon V450或 PE染色，在LSRFortess流式细胞仪上分析。所有抗体染料都采用生产商*的浓度。

CD8: 裂解的全血用人CD8结合Brilliant Violet 421，PacificBlue™，VioBlue®，BDHorizon V450或 PE染色，在LSRFortess流式细胞仪上分析。所有抗体染料都采用生产商*的浓度。

2 出色的细胞群分辨率

在很多情况下，常见的紫色激光激发的染料不够明亮，与现有的明亮的染料如PE或Alexa Fluor® 647相比，无法分辨弱表达细胞群体。然而，如上文所述，BrilliantViolet 421聚合物是一种明亮的荧光染料，当与针对低抗原密度的标志物抗体相结合时，会有出色的分辨率。这种荧光亮度，再加上其他荧光染料的干扰小，因此BrilliantViolet 421与其他蓝色或红色激光激发的染料的分辨率相同，甚至更好。

以下的例子中将CD25和CD127标记的Brilliant Violet 421与PE和Alexa Fluor® 647染色在一个识别调节性T细胞的7色方案中进行了比较。平行采用了两种方案：一种包含CD25 Brilliant Violet 421和CD 127 Alexa Fluor® 647(图3a和3c)，另一种则包含了CD25 PE和CD 127 Brilliant Violet 421（图3b和3d）。下面的点图显示了CD 25 Brilliant Violet 421和PE比较，如何*地区分CD25的阴性和阳性细胞群。和CD 127 Alexa Fluor® 647相比，CD127 Brilliant Violet 421也显示了更好的区分性能。这两种明亮的BrilliantViolet 421结合物的亮度能简单明确的识别CD25brightCD127dim群体（调节性T细胞），如图4所示。

图3，两种调节性T细胞方案的数据比较

图3a和3b比较了CD25Brilliant Violet 421和CD25PE的亮度。图3c和3d比较了CD127 Brilliant Violet 421 和 CD127 Alexa Fluor® 647的亮度。图3e和3f表明使用Brilliant Violet 421可清晰的区分调节性T细胞群。图3a-d显示了CD3+淋巴细胞的数据。图3e-f显示了CD3+ CD4+淋巴细胞的数据。

3 zui大限度的提高多色实验能力

7色TNK方案的数据举例

例如：在7色方案中使用CD8 Brilliant Violet 421，识别T细胞和NK细胞。裂解的全血用CD8 Brilliant Violet 421，CD3 APC-H7，CD7 PE，CD16 PE-Cy™7，CD45 BD Horizon V500，CD56 APC以及CD57 FITC染色。在BD FACSVerse流式细胞仪上检测。

细胞内染色方案使用Brilliant Violet 421举例

外周血单个核细胞（PBMCs）加入brefeldin A (BFA)，用金黄色葡萄球菌肠毒素（SEB）刺激6小时。然后细胞经过洗涤，用BD FACS™裂解溶液固定，BD FACS™ Perm2进行打孔，并用CD8 Brilliant Violet 421，CD3 FITC，CD4 PerCP-Cy™5.5，IFN-γ PE以及IL-2 APC染色。在BD FACSVerse流式细胞仪上进行分析，数据显示CD3+圈门的淋巴细胞。

4 适用于标准的细胞表面及胞内染色方案

Brilliant Violet 421适用于细胞表面和胞内染色方案中所用的标准缓冲液，包括BDCytofix™固定缓冲液/ BD Perm/wash™缓冲液，人FoxP3缓冲套装，BD Phosflow™固定缓冲液I / BDPhosflow™ 穿孔/ 洗涤缓冲液I，BDPhosflow™ 穿孔缓冲液II,和BD Phosflow™ 穿孔缓冲液III。以下的图显示了CD3Brilliant Violet 421根据不同染色方案染色的结果。请注意，不同的蛋白在不同的固定和穿孔条件下，各种蛋白的染色强度也会不同，因此缓冲液的适用性受到目标蛋白，荧光染料以及抗体的影响。

Brilliant Violet 421用不同方案染色举例

人CD3用多种染色方案染色的柱状图叠加：活细胞染色，固定/穿孔后细胞染色，或细胞染色后固定/穿孔。

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