目的基因亚克隆

亚克隆

已经获得的目的DNA条带进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。

亚克隆的基本过程包括：

（1）目的DNA条带和载体的制备；（2）目的DNA条带和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。

目的DNA条带和载体的制备
    选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，*不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。

利用T4 DNA连接酶进行目的DNA条带和载体的体外连接

连接产物的转化
⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；
⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；
⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；
⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。

重组子的筛选
   根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ 细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。