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原位杂交（FISH、IF双染）

服务介绍：

原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知序列核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。IF即免疫荧光，可检测组织或细胞中某蛋白的表达情况及定位。

原位杂交(FISH、IF双标)可以检测靶基因与靶蛋白的共定位情况。

实验流程：

石蜡切片荧光探针原位杂交与免疫荧光双标实验步骤

1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°C消化20-30min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

6、预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

7、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液,恒温箱37度杂交过夜。

8、杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

9、孵育一抗：滴加一抗，PBS稀释。4°过夜。后PBS洗3×5min。

10、孵育二抗：滴加相应二抗，室温孵育50min。后PBS洗3×5min。

11、DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

12、镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光;FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光;CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。) 　　

送样要求：

1、切片前处理要求：新鲜组织干冰运输后做冰冻切片；或取2mm左右厚度的新鲜组织，5min内投入原位杂交固定液内固定，4℃低温保存运输，切勿冷冻结冰，尽快包埋切片后进行原位杂交实验，固定时间过长影响核酸检出率；

2、冰冻切片：冰冻切片-20℃运输；

3、石蜡切片：石蜡切片常温运输；

4、细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，换无酶PBS，密封，4℃运输。 

单据填写：

1、探针合成：需提供待测目的基因序列或基因登录号、所需标记类型；

2、自带探针需告知完整探针信息；

3、写明检测要求。