TUNEL细胞凋亡检测试剂盒样品应该如何准备

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒样品应该如何准备

样品准备

A. 石蜡包埋组织切片

1）室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5min，重复一次，以*脱掉石蜡。

2）室温下用100%乙醇浸泡切片5min，重复一次。

3）室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

4）用PBS轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时，可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/ml。

6）每个样本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆盖，室温孵育20min。

【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）用PBS溶液润洗样本，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

B. 组织冰冻切片

1）将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室温下孵育15min。

2）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

3）将玻片浸没在PBS溶液中，室温孵育15min。

4）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时，可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/ml。

6）每个样本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆盖，室温孵育10min。

【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）用PBS溶液润洗样本2-3次。

8）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒样品应该如何准备

C. 细胞爬片的准备

在Lab-Tek载玻片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

D. 细胞涂片的制备

1）准备多聚赖氨酸包被的载玻片：吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚赖氨酸水溶液，滴至每一片预清洗过的玻璃载玻片的表面。在将要用于固定细胞的区域将多聚赖氨酸溶液涂散为一薄层。待载玻片晾干之后，迅速用去离子水漂洗，然后让包被后的载玻片在空气中晾干30-60 min。包被后的载玻片能在室温储存数月。

2）以约2×10⁷个细胞/ml的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取50-100μl细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

3）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。

4）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。重复用PBS洗一次。

5）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时，可用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

6） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/ml。

7）每个样本上滴加100μl上述Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室温孵育5min进行通透处理）。

【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

8）在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次。

9）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

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