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大分子抗原因其具有两个以上的抗原决定簇，而可用双抗体夹心法测定，小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3，T4及睾酮等激素因其只有一个抗原决定簇，从而无法使用双抗夹心方法测定，只能采用竞争抑制法测定。具体步骤如下：
1．先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭。
2．同时加入待测样本和酶标的小分子，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合。
3．加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比(图2—4)。
这种测定模式中，需要得到小分子与酶的结合物，而小分子酶结合物一则在制备上不如抗体酶结合物简便，二则其纯化亦颇为困难，结合有小分子的酶与游离酶之间难于分离。因此，有人尝试在合成二或多聚体小分子的基础上，建立双抗夹心竞争ELISA方法测定小分子，测定的灵敏度和特异性均有所提高(图2—5)。
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