体液外泌体（Exosome）提取试剂说明书

体液外泌体(Exosome)提取试剂(包括乳汁、唾液、尿液等）

适用范围：

1、可用于后续电镜观察、NanoSight纳米粒度分析，加入细胞共培养，Western blot、ELISA、蛋白质组学分析，小RNA提取和qPCR。

2、只需少量样品、孵育和台式离心，外泌体回收率稳定、结构完整纯度高。

3、媲美SBI公司ExoQuick和Invitrogen的Total Exosome Isolation外泌体分离试剂盒，是国内性加比zui高的外泌体提取试剂盒

描述：细胞内存在许多膜性囊泡(vesicle)结构，可以分泌排到胞外--即外泌体(exosome)，也称为microvesicle或microparticle--它们均可称为extracellular vesicle。外泌体直径约30~150 nm，携带多种核酸，蛋白酶、MHC、骨架蛋白、热休克蛋白、miRNA和脂质信号分子。外泌体分泌到细胞外基质后，可jing血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、淋巴等体液运送到相邻或远隔的组织细胞并被其摄取，因而在同类或不同类型的细胞间的物质和信息远程交换中起重要作用。外泌体调节许多细胞功能，如免疫调控、肿瘤新生和转移，或为疾病早期诊断标志物，也可作为药物载体。

外泌体分离纯化的经典方法是超速离心或密度梯度离心法，但需要超速离心机和大量样品、操作繁琐耗时，回收率和纯度不稳定。外泌体制备试剂盒能替代超速离心法，适应少至100µl 的样品，只需孵育和台式离心，即可制备出高纯度外泌体，用于后续蛋白、RNA检测试验。

操作步骤

1.       样品预处理：3000× g离心15分钟去除细胞和碎片，上清转移到新管用于提取外泌体。如需制备更高纯度的外泌体，可用0.22µm滤膜过滤离心上清一次。

2.       每1体积的样品，加入0.2体积的外泌体纯化试剂。例如1ml样品加0.2ml外泌体纯化试剂，5ml样品加1ml外泌体纯化试剂，充分混匀。

3.       4 ºC孵育12小时，无需摇动。注意：血清血浆富含蛋白，孵育可缩短至1个小时。

4.       1500× g离心15分钟收集外泌体沉淀，弃上清。常温或4 ºC离心不影响结果。

5.       1500× g再次离心5分钟，小心吸除残余液体，勿触动外泌体沉淀。

6.       加100µl PBS重悬外泌体沉淀。若初始样品及外泌体沉淀多可多加PBS重悬。后续若进行Western blot可直接加50-100 µl RIPA Lysis Buffer裂解外泌体。如提取RNA可在PBS重悬外泌体后，采用RNAtrip LS 液体样品RNA提取试剂R1020提取外泌体RNA。

说明：通常1 ml细胞培养上清分离的外泌体能满足一次Western blot实验。外泌体常见标志蛋白CD63, CD9, CD81, Tetraspani, HSP70，可用RIPA Lysis Buffer、全套Western blot试剂、Super ECL Plus超敏发光液检测。RNAtrip LS液体样品RNA提取试剂可纯化外泌体小RNA。 

若提取外泌体用于蛋白分析，对于外泌体含量高的样品：血清、血浆、腹水、唾液、乳汁，可采用500µL (或100-500µL)的初始样品量，再加入等体积的预冷PBS缓冲液稀释混匀，然后根据稀释后的终体积，再加入0.2体积的外泌体提取试剂。对于外泌体含量较低的样品：组织块培养上清、细胞培养上清、尿液、脑脊液，可采用1 ml样品体积，不用PBS稀释，处理后直接加入提取试剂。若提取的外泌体用于小RNA和qPCR分析，建议采用较大体积的样品，例如5-10ml。

采用EDTA而非肝素抗凝血，以免影响后续PCR。