细胞培养基谷氨酰胺比色法定量检测试剂盒产品说明书

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GENMED 细胞培养基谷氨酰胺比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途
GENMED 细胞培养基谷氨酰胺比色法定量检测试剂是一种旨在通过谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的双酶循 环反应系统测定细胞培养基样品中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的消耗量，即采用比色法测 定其氧化后峰值的变化，进行测算谷氨酰胺含量的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研 制、成功实验证明的。其适用于细胞培养前和培养中的各种细胞培养基中谷氨酰胺的检测。产品严格无菌， 即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
L-谷氨酰胺是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一。是人体内zui普遍的、不可缺乏的条件性必需氨基 酸，是构成蛋白质*的氨基酸之一，更是某些细胞培养中zui基本的元素。由于谷氨酰胺不稳定的特 性，在细胞培养基的整合中，易自发性分解为谷氨酸和氨离子，而氨离子对细胞的毒性很强，因此，在细 胞培养体系中，须密切关注谷氨酰胺的储存寿命（SHELF LIFE）和实时监测。在谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢 酶的双酶循环反应系统中，L-谷氨酰胺首先发生脱氨基反应，产生谷氨酸和氨离子；进一步氨与2-酮戊二 酸反应再次产生谷氨酸，同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）氧化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP+），即测定NADPH（340nm 波长）的浓度变化，来定量分析谷氨酰胺的含量， 其反应方式为：
产品内容
GENMED 缓冲液（Reagent A） 毫升 GENMED 反应液（Reagent B） 微升 GENMED 阴性液（Reagent C） 毫升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 微升 产品说明书 1 份
保存方式
保存 GENMED 反应液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 在－20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里；GENMED 反应液（Reagent B）避免光照；有效保证 6 月
用户自备
无离子水：用于溶解样品 过滤纸：用于样品澄清处理 封口膜：用于样品密封
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15 毫升锥形离心管：用于制备样品的容器 比色皿：用于比色的容器 96 孔酶标板：用于比色的容器 分光光度仪：用于比色分析 酶标仪：用于微量样品比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 GENMED 反应液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E）置入冰槽里融化。GENMED 反应液（Reagent B）避免光照；同 时设定好分光光度仪（温度为 25℃）：波长 340nm，并置零。然后进行下列操作。 一、（选择操作）样品准备（注意：参见注意事项4） 1． 移取 5 毫升待测细胞培养基到 15 毫升锥形离心管 2． 放进台式离心机离心 10 分钟，速度为 1500g 3． 移取上清液到新的 15 毫升锥形离心管 4． （选择步骤）可以加入适量的用户自备的无离子水稀释（如果 L－谷氨酰胺浓度过高） 5． （选择步骤）过滤纸过滤（如果离心处理，样品仍然不清澈） 6． 封口膜封口备用 二、背景对照定 1． 移取 xx 微升 GENMED 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升 GENMED 阴性液（Reagent C） 3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 4． 上下倾倒数次，混匀 5． 室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟 6． 放进分光光度仪，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反应液（Reagent B） 9． 上下倾倒数次，混匀 10．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 11．即刻放进分光光度仪测读（此为初始读数） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下倾倒数次，混匀 14．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 15．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（此为终点读数） 16．实际读数（初始读数－终点读数）：此为背景空对照实际读数 三、样品总活性测定 1． 移取 xx 微升 GENMED 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制备的待测样品（注意：样品须清澈）
3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D）
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4． 上下倾倒数次，混匀 5． 室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟 6． 放进分光光度仪，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反应液（Reagent B） 9． 上下倾倒数次，混匀 10．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 11．即刻放进分光光度仪测读（此为初始读数） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下倾倒数次，混匀 14．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 15．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（此为终点读数） 16．实际读数（初始读数－终点读数）：此为样品总活性读数 四、 样品非特异活性测定 1． 移取 xx 微升 GENMED 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制备的待测样品（注意：样品须清澈） 3． 加入 xx 微升 GENMED 阴性液（Reagent C） 4． 上下倾倒数次，混匀 5． 室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟 6． 放进分光光度仪，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反应液（Reagent B） 9． 上下倾倒数次，混匀 10．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 11．即刻放进分光光度仪测读（此为初始读数） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下倾倒数次，混匀 14．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 15．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（此为终点读数） 16．实际读数（初始读数－终点读数）：此为样品非特异活性读数 五、 计算样品浓度： [（样品总活性读数－样品非特异活性读数－背景读数）X 样品稀释倍数 Xxx（毫升，测定容量）]÷[xx（样 品容量，毫升）Xxx（毫摩尔吸光系数）]＝微摩尔/毫升÷（样品重量）毫克/毫升＝微摩尔/毫克 六、 酶标板测定 1． 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照、样品总活性、样品非特异活性 2． 分别移取 xx 微升 GENMED 缓冲液（Reagent A）到相应孔中
3． 按下表分别加入：
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背景对照孔
样品总活性孔
样品非特异活性孔
GENMED 阴性液（Reagent C）
微升
――
微升
待测样品
――
微升
微升
GENMED 酶促液 I（Reagent D）
微升
微升
――
4． 轻轻摇动酶标板，混匀 5． 室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 6． 放进酶标仪，置零 7． 取出酶标板 8． 分别加入 xx 微升 GENMED 反应液（Reagent B） 9． 轻轻摇动酶标板，混匀 10．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 11．即刻放进酶标仪测读（此为初始读数） 12．取出酶标板，分别加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．轻轻摇动酶标板，混匀 14．室温下（温度为 25℃）静置 5 分钟，避免光照 15．即刻放进酶标仪检测，此为背景空对照和样品读数（此为终点读数） 16．实际读数：初始读数－终点读数 17．浓度计算： [（样品总活性读数－样品非特异活性读数－背景读数）X 样品稀释倍数 X xx（毫升，测定容量）]÷[xx（样 品容量，毫升）X xx（毫摩尔吸光系数）X 0.6]＝微摩尔/毫升÷（样品重量）毫克/毫升＝微摩尔/毫克
注意事项
1． 本产品为 21 次（10 个样本）操作，包括背景对照 2． 操作时，须戴手套 3． 本产品检测范围在 0 至 50 微克/毫升（0 至 350 微摩尔）谷氨酰胺 4． 如果样品含有过高的脂质和蛋白成分和过深的色素，建议进行样品澄清处理（去色、去脂、去蛋白、 去气体等）；本公司提供 GENMED 谷氨酰胺待测样品处理试剂盒－GMS19027.6 5． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次 6． 样品须澄清，至关重要 7． 反应 5 分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；如果仍有波动，建议适当延长检测时间， 直至读数稳定 8． 比色测定后，比色皿须清洗* 9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 10．本公司提供系列营养学元素检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定