基质金属蛋白酶（MMP2/9）明胶酶谱法试剂盒说明书

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基质金属蛋白酶（MMP2/9）明胶酶谱法试剂盒说明书

描述：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解 细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组 织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的 MMP-2、MMP-9 参与各种生理与病理过程，其在研究诊断和治疗中的意义日益受到重视   1。

本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一种广为使用的、基 于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达 1 nM，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的 SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电 泳， 电泳结束后取出凝胶与酶反应 Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮区域，从而能同时指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供
MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶谱及活性，检 测灵敏度~1 nM。试剂盒可进行 50 次标准小胶检测，如果小胶加样孔为 10~15
个，则总计可检测 500~750 个样品。
适用: 检测 MMP-2、MMP-9 酶谱及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 组成与储存 (50 assays)：
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用时用蒸馏水稀释；
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用时用蒸馏水稀释；
5. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(#P1501), 4 oC。

检测步骤：
1. 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化，并 90 oC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 TEMED，等待凝胶聚合。
2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染  Marker   即可。阳 性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100μl 全血与 100μl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等体积混合，取 5-15μl 上样。
3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20    mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入  10    ml
1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。
5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或 37oC 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低，应延长孵育时间为 10 小时。
6.  显色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出现透 明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑 色。MMP      条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

说明
1. 10 mM 能够 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置(#P2000)室温快速干燥凝胶，作为*记录保留。

参考文献：
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书 P1501

常规考马斯亮蓝 SDS-PAGE 凝胶蛋白质染色是实验室常用的凝胶染色方法。银染方法虽然灵敏度 高，但所需试剂复杂并且有毒有害，操作步骤繁琐，难以控制获得好的染色效果。

染色步骤：
1. 此染色液即为工作液，使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝 胶，并缓慢摇动 2h；
2. 倾去染色液，用脱色液冲洗凝胶；
3. 以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动 2h，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的 蓝色的条带和干净的背景（通常此过程需要 2～4h，也可脱色过一夜至清晰的蓝色的条带和干净 的背景）；
4. 对凝胶进行分析和照相，凝胶可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置（P2000）对 凝胶进行处理后保存。
安全性：含有甲醇，无特殊毒性，按一般化学品操作规程处理。 说明：
1. 染色液配方：0.25g 考马斯亮蓝 R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至 1000ml，混合 1h 后用 Whatman 1 号滤纸过滤，于室温可无限期保存；
2. 脱色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 保存液：7％冰醋酸；
4. 凝胶染色之后，染色液可以回收利用，装入新容器内，室温或 4 oC 保存，可反复使用 2-4 次。