丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒操作步骤详解

丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒

测定意义 PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

测定原理 PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。 需自备的仪器和用品 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制 试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 试剂八：粉剂×1支，4℃保存; 工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用。 PDH的提取
1、 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 4 ℃ 600 g离心5min。
3、 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。
5、 在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于PDH活性测定。
丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒测定步骤
1、 调零
用蒸馏水于605nm处调零。
2、 样本测定
（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。 （2）取出比色皿，加入50μL酶液，混匀；立即记录605nm处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应1min，记录605nm处1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 注意事项 1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。 2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

PDH活性计算 1、组织中PDH活性计算: （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10-3）×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL) （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH（U/g 鲜重）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10-3）×ΔA ÷样本鲜重(g/mL)=905×ΔA ÷样本鲜重(g/mL) 2、细菌或培养细胞中PDH活性计算： （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10-3）×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL) （2） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/104 cell）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10-3）×ΔA ÷细菌或细胞密度(104 cell /mL)=905×ΔA÷细菌或细胞密度(104 cell /mL)

丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒