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没有BSL-4实验室也能安全进行病毒研究?

阅读:1314      发布时间:2022-7-11
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Abstract


新型病毒对人类健康构成了不容小觑的严重威胁,它们引起的感染往往会导致严重的疾病,甚至死亡,因为人类免疫系统尚无力对抗一种陌生的病毒,特别是人畜共患的病毒。最近的疫情也表明了新型病毒的危险性。假型病毒可用于轻松研究此类病毒的进入路径。


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下载本篇《利用假型病毒对高致病性病毒进行研究》应用说明了解超纯水质量在这种假型病毒制备中的重要性。

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简介

由于种间传播或病毒基因组的自然变化,新型病毒已具备对人类造成感染的能力,各种因素都会促进新型病毒的发生和传播。在过去100年里,发生了多次新型病毒感染人类的情况,导致了局部出现疫情或全球传播(大流行;见表1)。

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表1:新病毒的爆发

对于新型病毒的研究目前一般局限于生物安全级别(BSL)达到 3 级或 4 级的高安全性实验室(见表1)。BSL-4实验室的工作非常费力且成本昂贵,而且仅可在少数几个地点进行,因此很难在表征病毒病原体和开发抗病毒的药物方面取得快速的科学进展。

在这种情况下,假型病毒为安全有效地研究高致病性病毒进入细胞提供了一个有效的选择。假型的常用系统基于弹状病毒(例如,水泡性口炎病毒、VSV;图1)和逆转录病毒。

本项研究的目的是验证包膜蛋白介导的假型病毒进入是否反映了完整病毒的宿主细胞进入,以及确定所用试剂(在本例中为实验室用水)的纯度水平对假型病毒产生的影响。

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图1:假型VSV的制备:
1)VSV G反式互补VSV进入表达包膜蛋白的细胞。
2)中和过量病毒。
3)将待研究的包膜蛋白包埋在假型VSV的膜中,收获假型VSV。


材料和方法

采用含 10 %胎牛血清和 1 %青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基在 37 °C和 5 % CO2下培养HEK-293T、MDCKII和Vero E6细胞。传代和接种时,细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,用胰蛋白酶/EDTA消化分离。

将VSV糖蛋白(VSV G)、埃博拉病毒糖蛋白(EBOV GP)、中东呼吸综合征冠状病毒S糖蛋白(MERS-CoV S) 、H1N1(1918)的甲型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA) 病毒包膜蛋白的质粒用作表达载体。

此外,使用二肽基肽酶4(DPP4)的表达质粒。空白表达质粒作为对照。使用钙|磷酸盐沉淀转染HEK-293T细胞,其中所有缓冲液和溶液均使用去离子水或赛多利斯Arium® Pro VF超纯水制备。

- 超纯水的制备
使用Arium® Pro VF制备的超纯水,水的TOC含量降至 2 ppb,电导率为 0.055 μS/cm(18.2MΩ×cm的电阻率),补偿至25°C。

- 假型VSV的制备
使用复制缺陷型VSV载体制备假型VSV,其中VSV糖蛋白(VSV G)的基因组信息被两个报告基因替代,且 VSV G必须以反式提供。

- 用唾液酸酶或抑制剂预处理靶细胞
用 200 mU重组唾液酸酶处理MDCKII细胞,以从质膜的糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸。

- 分析包膜蛋白介导的宿主细胞进入
将靶细胞和假型VSV培养 1 小时,然后用PBS洗涤,并进一步用细胞培养基培养 16 – 20 小时。之后,使用萤光素酶裂解缓冲液裂解细胞,并且使用市售的测定试剂盒在化学发光仪中测量细胞裂解物中萤光素酶活性,以评估由包膜蛋白介导的转导的效率。


结果
如果假型的包膜中嵌入了MERS-CoV S,则DPP4的定向表达使假型VSV进入宿主细胞显著增加(见图2A)。

唾液酸的去除导致假型VSV进入宿主细胞显著减少,该假型VSV有H1N1(1918)HA/NA嵌入其包膜中(见图2B)。这一发现证实假型病毒反映了真正的甲型流感病毒进入细胞的机制。

屏幕截图 2022-07-11 112357.png

图2. 假型病毒受体依赖性进入细胞:
(A)将具有VSV G或MERS-CoV S的假型VSV用于接种之前已经用空载体(无受体)或人二肽基肽酶4(DPP4)的表达质粒转染的HEK-293T细胞。

(B)用具有VSV G或H1N1 (1918) HA/NA包膜蛋白的假型VSV接种经唾液酸酶预处理或未经处理的MDCKII细胞。转导效率,即进入效率,由病毒编码的萤光素酶的活性确定并标准化。此外,数据的统计显着性通过t检验得到确认(*:p<0.05)。


埃博拉病毒糖蛋白在细胞进入过程中的激活具有pH依赖性并且需要半胱氨酸蛋白酶活性。在假型VSV背景下的EBOV GP介导的细胞进入还取决于酸性环境(见图3A)和半胱氨酸蛋白酶的活性(见图3B)。

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图3:假型病毒pH依赖性进入细胞:
带VSV G或EBOV GP的假型VSV用于接种预先用巴佛洛霉素A1(A)或E-64d(B)处理的Vero E6细胞(未处理的细胞用作对照)。通过病毒编码的萤光素酶的活性确定假型病毒的转导效率,即进入效率,并将所得数据标准化。此外,数据的统计学意义通过t检验得到确认(*:p<0.05)。



实验室用水的水质影响假型VSV的质量:

在平行实验中生成两批假型VSV:一批使用中心实验室供水源的去离子水(19 °C时电导率为 3.7 – 4.1 μS/cm)作为所有溶液和缓冲液的基本溶剂;另一批使用基于Arium® Pro VF超纯水的溶液和缓冲液(电导率为0.055 μS/cm,补偿至 25 °C)来制备。检测了作为包膜蛋白的EBOV GP和MERS-CoV S。通过保持相同的孵育条件平行生产假型VSV,接种靶细胞,并量化包膜蛋白介导的假型VSV进入。

实验表明,使用Arium® Pro VF超纯水作为所有缓冲液和溶液的基本溶剂生产的假型VSV的宿主进入(作为质量程度的参数)显著高于使用去离子水的假型的宿主进入(图4)。

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图4:实验室用水的纯度水平影响假型病毒的质量:
具有EBOV GP或MERS-CoVS的假型VSV用基于去离子水(显示在“去离子水"状态下)和Arium® Pro VF超纯水(显示在“超纯水"状态下)的缓冲液和溶液制备,并用于接种Vero E6细胞。通过定量病毒编码的萤光素酶来确定假型病毒的转导效率,即进入效率,并将所得数据标准化。此外,数据的统计学意义通过t检验得到确认(*:p<0.05)。


讨论

本研究以复制缺陷型水疱性口炎病毒(VSV)为基础产生假型病毒,并对各种高致病性病毒的包膜蛋白进行了研究。我们发现宿主细胞进入依赖于如真实病毒所描述的相同受体分子和生化过程。此外,我们还证明使用超纯水生产假型VSV可以优化这一过程。

假型病毒是研究高致病性病毒进入宿主细胞的重要工具,不需要将这种高致病性病毒的研究限制于BLS-3或BLS-4实验室。假型病毒的使用还降低了劳动强度、成本和其它诸多限制性因素,并显著提高了操作的安全性。


Arium® Pro VF超纯水系统

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