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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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产品简介
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 100T |
|---|---|---|---|
| 货号 | 41303ES60 | 应用领域 | 医疗卫生,生物产业,制药 |
| 主要用途 | 用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的试 |
产品介绍
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格（元） |
Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒 | 41303ES50 41303ES60 | 50T 100T | 8895.00 16425.00 |
产品描述
Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero宿主细胞DNA残留片段含量的试剂盒。
本试剂盒采用PCR荧光探针原理，专一快速的检测Vero细胞的残留DNA，其检测限可以达到fg平。试剂盒配套有Vero DNA Control（DNA定量参考品）。本试剂盒需要与磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461/18462）配套使用。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |
41303ES50（50T） | 41303ES60（100T） | ||
41303-A | Vero qPCR mix | 0.8 mL | 1.6 mL |
41303-B | Vero Primer&probe mix | 200 μL | 400 μL |
41303-C | DNA Dilution Buffer | 2×2 mL | 4×2 mL |
41303-D | Vero DNA Control（30 ng/μL） | 25 μL | 50 μL |
【注】：适用机型（包含但不限于以下仪器）：
Bio-Rad：CFX96 Optic ModμLe；
Thermo Scientific：ABI 7500；ABI QuantStudio 5；ABI StepOnePlus；
上海宏石医疗科技：SLAN-96S.
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃储存，有效期2年。收到货后，建议将D组分Vero DNA Control储存于－80℃，其它组分储存于－20℃。
注意事项
1. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。
2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途。
使用方法
一、Vero DNA Control的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer将Vero DNA Control进行梯度稀释，稀释浓度依次为 300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL
具体操作如下：
1. 将试剂盒中的Vero DNA Control和 DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待*融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。
2. 取7支干净的1.5 mL离心管，分别标记为 3 ng/μL，①，②，③，④，⑤，⑥。
3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control，即稀释为 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心10 sec，该浓度可分装置于－80℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。
4. 在①，②，③，④，⑤，⑥ 管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：
稀释管 | 稀释比例 | 终浓度 |
① | 10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer | 300 pg/μL |
② | 10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer | 30 pg/μL |
③ | 10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer | 3 pg/μL |
④ | 10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer | 300 fg/μL |
⑤ | 10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer | 30 fg/μL |
⑥ | 10 μL ⑤+90 μL DNA Dilution Buffer | 3 fg/μL |
【注】：1. 每个浓度做3个复孔。该试剂可测试3 fg/μL-3 ng/μL线性范围，如需要，可扩大或缩小线性范围。
2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于－80℃。
3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，如长时间不用请放置于－20℃。
4. 为确保模板*混匀，每个梯度稀释时需震荡混匀1 min以上。
二、加样回收质控QC的制备
根据需要设QC中的Vero DNA加样浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的样本QC为例），具体操作如下：
取100 μL待测样本加入1.5 mL干净的离心管中，再加入10 μL②，混匀，标记为加样回收QC。
加样回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加样回收QC纯化液。
三、标准品回收质控QC的制备（可选）
根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度（以加3 pg/μL DNA 标准品为例），具体操作如下：
取100 μL 3 pg/μL定量参考品的稀释液加入1.5 mL干净的离心管中，标记为标准品回收QC。
标准品QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品QC纯化液。
四、阴性质控NC的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL干净的离心管中，标记为阴性质控NC。
阴性质控NC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NC纯化液。
五、反应体系
组分 | 体积（μL） |
Vero qPCR mix | 16 |
Vero Primer&probe mix | 4 |
DNA template | 20 |
总体积 | 40 |
【注】：1. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量：qPCR MIX =（反应孔数+2）×40 μL（含有2孔的损失量）。实验中每一个样品模板最好重复做3个以上。
2. 加样完成密封好管子后，请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，*混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
下图为参考板位：
该示例表示的是检测6个浓度梯度的DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、3个阴性质控NC、3个待测样本、3个加样回收QC和3个标准品回收QC。每个检测做3个重复孔。
六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）
创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
创建1个检测探针，命名为Vero-DNA，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为none。
在Assign target (s) to the selected wells面板中，将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard，并且在Quantity 一栏分别赋值为300000、30000、3000、300、30、3（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL，3 fg/μL；将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC；将阴性质控NC孔、待测样本孔、样本QC孔的Task一栏设置为Unknown，并且在相应的Sample Name一栏中命名为NTC、NC、YP、QC，之后点击 。
4. 扩增程序设置：设置反应体积40 μL。
循环步骤 | 温度（℃） | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 min | 1 |
变性 | 95℃ | 15 sec | 40 |
退火/延伸（收集荧光） | 60℃ | 30 sec |
七、qPCR 结果分析
在 Analysis的Amplification Plot面板中，系统会自动给出Threshold，有时系统给出的Threshold离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节Threshold至合适位置，点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在Analysis的Standard Curve面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R²、扩增效率（Eff%）。正常的标曲，R²＞0.99；90%≤Eff%≤110%。
3. 在Analysis的View well table面板中，Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本、样本ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。
HB220322
