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供货周期 | 现货 | 规格 | 5T |
---|---|---|---|
货号 | 12299ES05 | 应用领域 | 医疗卫生,化工,生物产业 |
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格/元 |
Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit for Illumina® DNA&RNA 共建库试剂盒 | 12299ES05 | 5 T | 1915 |
12299ES24 | 24 T | 7985 | |
12299ES96 | 96 T | 29985 |
产品描述
Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®测序平台的DNA&RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA反转录试剂,常规dscDNA合成试剂,DNA---片段化试剂,接头连接试剂,以及文库扩增试剂。本产品利用专业开发设计的新一代片段化酶可以完成DNA和RNA一管式建库,简化了操作流程,极大的降低了建库时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于mNGS样本,肿瘤样本,复杂样本等的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
组分编号和名称 | 12299ES05 | 12299ES24 | 12299ES96 | ||
12299-A | dT23VN | 5 μL | 24 μL | 96 μL | |
12299-B | Random Primer | 5 μL | 24 μL | 96 μL | |
12299-C | 1st Reaction Buffer | 40 μL | 192 μL | 768 μL | |
12299-D | 1st Strand Enzyme Mix | 10 μL | 48 μL | 192 μL | |
12299-E | 2nd Reaction Buffer | 35 μL | 168 μL | 672 μL | |
12299-F | 2nd Strand Enzyme Mix | 15 μL | 72 μL | 288 μL | |
12299-G | Smearase Buffer | 50 μL | 240 μL | 960 μL | |
12299-H | Smearase Enzyme Mix | 25 μL | 120 μL | 480 μL | |
12299-I | Ligation Enhancer | 150 μL | 720 μL | 2×1440 μL | |
12299-J | Novel T4 DNA Ligase | 25 μL | 120 μL | 480 μL | |
12299-K | 2×Super Canace® II High-Fidelity Mix | 125 μL | 600 μL | 2×1200 μL | |
12299-L | Primer Mix | 25 μL | 120 μL | 480 μL |
运输与保存方法
干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。
二、关于接头连接(Adapter Ligation)
1. 本公司可提供长接头(Indexed Adapter)试剂盒和短接头(也称为小Y接头、不完整接头)试剂盒,客户可根据实验需求进行选择。
目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612);双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)。
2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。
3. 使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。
4. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的DNA或者RNA投入量,参考表1,表2对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM,接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1. Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表
表2. Input Total DNA量与接头使用浓度推荐表
Input Total DNA | Adapter stock concentration |
1μg~200 ng | 15 μM |
100 ng | 10 μM |
50 ng | 5 μM |
10 ng | 3 μM |
5 ng | 1.5 μM |
1 ng | 1 μM |
三、关于文库扩增(Library Amplification)
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真 DNA 聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。
2. 如果您使用 Indexed Adapter(也称为长接头、大 Y 接头),可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增;如果使用的是“短接头"或者叫“小 Y 接头",则需要使用 Index Primers 进行扩增,加上相应的 Index。
3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表 3 列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。
4. 表3中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求,若您的样本质量较差(如降解严重的FFPE样本),可根据实际情况适当增加循环数。
表3. Input Total RNA或者DNA量与扩增循环数推荐表*
Input Total RNA | Number of cycles | Input Total DNA | Number of cycles |
10 ng | 14~15 | 1 ng | 12~15 |
100 ng | 10~11 | 5 ng | 10~14 |
1 μg | 7~8 | 10 ng | 8~12 |
50 ng | 7~8 | ||
100 ng | 6~7 | ||
200 ng | 5~6 | ||
500 ng | 4~5 | ||
1 μg | 3~4 |
【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑,选择最合适的建库条件。
四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。
五、关于文库质检(Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
六、自备材料(Other Material)
1. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads(A63880)或其他等效产品。
2. Adapters:含Index的长接头(Yeasen Cat#12615~12618)或者无Index的短接头试剂盒(Yeasen Cat#12611~12612)。
3. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。
4. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
建库流程图
图1.DNA& RNA共建库操作流程
使用方法
Step 1 RNA变性
1. 将 Dt23VN、Random Primer 室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。按照下表配置反应液:
表4. RNA预变性反应体系
名称 | 体积(μL) |
Dt23VN | 1 |
Random Primer | 1 |
DNA&RNA | 13 |
Total | 15 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行RNA的预变性。
表5.第一链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 75°C | On |
70°C | 5 min |
立即置于冰上 | 3 min |
Step 2 第一链cDNA的合成(1st Strand Synthesis)
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出,室温解冻,颠倒混匀后瞬离。按表6所示,配制第一链cDNA合成的反应液。
表6.第一链cDNA合成反应体系
名称 | 体积(μL) |
变性的RNA | 15 |
1st Reaction Buffer | 8 |
1st Strand Enzyme Mix | 2 |
Total | 25 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表7.第一链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 105°C | On |
25°C | 5 min |
42°C | 30 min |
85°C | 5 min |
4°C | Hold |
Step 3第二链cDNA的合成(2nd Strand Synthesis)
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表8所示,配制第二链cDNA合成反应液。
表8.第二链cDNA合成反应体系
名称 | 体积(μL) |
1st Strand cDNA | 25 |
2nd Reaction Buffer | 7 |
2nd Strand Enzyme Mix | 3 |
Total | 35 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表9所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。
表9.第二链cDNA合成反应程序
温度 | 时间 |
热盖 | Off |
16°C | 30 min |
4°C | Hold |
Step 4 DNA---片段化/末端修复/dA尾添加(DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing)
该步骤将DNA---片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。
1. 将表10中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表10反应体系。
表10. DNA---片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系
名称 | 体积(μL) |
2nd Strand cDNA | 35 |
Smearase Buffer | 10 |
Smearase Enzyme Mix | 5 |
H2O | 10 |
Total | 60 |
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表11所示反应程序,进行DNA---片段化,末端修复及dA尾添加反应。
表11.DNA---片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序
温度 | 时间 |
热盖105°C | on |
4°C | 1 min |
30 °C | 5-20 min** |
72 °C | 20 min |
4°C | Hold |
【注】:*DNA---片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表12。
表12.片段化时间选择表
插入片段主峰大小 | 片段化时间 |
300~500 bp | 5 min |
250 bp | 10 min |
200 bp | 15 min |
150 bp | 20~30 min |
图2. 不同片段化条件下的文库峰形
Step 5 接头连接(Adapter Ligation)
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的Illumina®接头。
1. 参考注意事项二中的表1或表2,根据Input DNA或RNA量,稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。
表13. Adapter Ligation体系
名称 | 体积(μL) |
dA-tailed DNA | 60 |
Ligation Enhancer | 30* |
Novel T4 DNA Ligase | 5 |
DNA Adapter | 5** |
Total | 100 |
【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1或表2的提示,根据投入量对接头进行稀释,使接头添加体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表14所示反应程序,进行接头连接反应:
表14. Adapter Ligation反应程序
温度 | 时间 |
热盖 | Off |
20°C | 15 min |
4°C | Hold |
Step6连接产物纯化(Post Ligation Clean Up)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。
Step 7 文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表15中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表15所示反应体系。
表15.短接头连接产物PCR反应体系
组分名称 | 体积(μL) |
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix | 25 |
Universal Primer/ i5 Primer* | 2.5 |
Index Primer/ i7 Primer* | 2.5 |
Adapter Ligated DNA | 20 |
Total | 50 |
【注】:*如果使用的是无Index的接头,俗称短接头(小Y接头),请使用短接头试剂(Cat#12611~ Cat#12612,Cat#12414~ Cat#12415,)中配备的Index primer进行扩增。
**如果您使用的是Indexed Adapter(Cat#12615~ Cat#12618),俗称长接头(大Y接头),可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增;
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表16示反应程序,进行PCR扩增。
表16.PCR扩增反应程序
温度 | 时间 | 循环数 |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 3~15cycles* |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 1 min | 1 |
4°C | Hold | - |
Step 8 扩增产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。
Step 9 文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。
HB210701