产品信息

产品描述

文库稀释液 Library Dilution Buffer (10 mM Tris-HCl ，pH 8.0 [25℃]，0.05% Tween 20)，用于不同种类建库试剂盒最终文库的稀释，请勿使用水或 TE 作为稀释液。稀释后的文库和解冻后的DNA Standards（12307ES09）置于冰上存放，文库应现用现稀释，用完丢弃。本产品可搭配qPCR Master Mix（Cat#12302: 包含定量所需的 qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料 ROX。扩增引物根据 NGS 文库接头序列 P5 和P7 设计，可保证特异性扩增双端接头完整的文库；qPCR Master Mix 是基于抗体法热启动的染料法 qPCR 预混液。）使用，可对不同长度、不同 GC 或 AT 含量样本高效、特异扩增，实现精确定量。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分 -20℃ 保存，有效期 12 个月。

注意事项

一、关于操作

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.请于使用前确保产品冻融和*混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

3.为保证产品品质，避免反复冻融超过 30 次！

4.为避免样品交叉和气溶胶污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5.试剂吸取时应保证枪头适当深入液体，排出时应确认枪头无残留。

6.为避免交叉污染，建议在不同区域分别进行模板制备、体系配制和加模板操作。

二、关于文库稀释

由于 DNA 在非缓冲环境中易降解，因此应使用缓冲稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，对应货号12303ES50）稀释文库，切勿使用水或TE作为稀释液。测定时，文库应现测现稀释，置于冰上待测，切勿使用以往配制储存的稀释文库。

文库需稀释至标准曲线有效 Ct 范围内进行定量，稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考（如NanoDrop®，Qubit®或 Bioanalyzer）。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。

三、污染与阴性对照（Contamination and No-template Controls）

1.进行qPCR 实验时，应保证良好的实验操作规范，以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA 标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离，并定时使用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。

2.反应体系配制过程中DNA Standards 的加入应按照从低浓度至高浓度（DNA Standard 6 至 1）的顺序进行，每次移液都应更换新的枪头，以避免气溶胶污染。

3.每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应，配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina®平台固定序列而非 qPCR 专用引物序列，且扩增循环数较多，NTC 阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生 Ct 属正常情况。正常情况下 Ct（NTC）> Ct （DNA Standard 6）+ 3。

使用方法

一、解冻试剂

将文库稀释液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20，对应货号12303ES50），从冰箱中拿出，置于室温 30 min 以上。确保各试剂*解冻并*混匀，短暂离心后置于冰上备用。

二、稀释文库

使用文库稀释液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20，对应货号12303ES50）对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:10000-1:100000。对于高浓度文库，可额外设置 3 个 2 倍稀释梯度，如按 1:10000 稀释文库，可额外设置 1:20000，1:40000，1:80000 稀释比例，以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。

三、反应体系配制

于反应管中配制体系（如下表），上下颠倒或涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

注：1）每个反应至少设置 3 个平行；2）推荐进行 20 μL 反应体系，如需进行 10 μL 反应，则将体系各组分等比减少；3）*在阴性对照反应管中加入ddH2O；在样品反应管中加入稀释后的文库；在标准曲线反应管中加入DNA Standards；4）根据仪器选择合适的ROX，推荐使用量为 0.5 μL。

四、qPCR 运行程序

将反应管置于 qPCR 仪中，按下述条件（如下表）设置 qPCR 反应程序，并运行（熔解曲线可根据仪器默认即可）。

注：*若文库平均长度超过600 bp，应将退火延伸时间由45 sec延长至90 sec。

五、数据分析

1.标准曲线制作

1)根据复孔间 Ct 差异≤0.2 的原则，对 DNA Standards 原始 Ct 进行过滤，并计算平均 Ct。

2)使用有效范围内的 Ct（作为纵坐标）和 Log[pM]（作为横坐标）绘制标准曲线。参照 NTC 阴性对照 Ct 确认标准曲线 Ct有效范围。

若 Ct (NTC) > Ct（DNA Standard 6）+ 3，则最大有效 Ct 为 Ct（DNA Standard 6），应使用 DNA Standard 1-6 所产生的 Ct 绘制标准曲线；

若Ct（DNA Standard 6）+ 3 > Ct (NTC) > Ct （DNA Standard 5）+ 3，则最大有效 Ct 为Ct （DNA Standard 5），应使用 DNA Standard 1-5 所产生的 Ct 绘制标准曲线；

若Ct（DNA Standard 5）+ 3 > Ct （NTC）> Ct（DNA Standard 4）+ 3，则最大有效 Ct 为Ct（DNA Standard 4），应使用 DNA Standard 1-4 所产生的 Ct 绘制标准曲线；

基于定量准确性考虑，请至少使用 4 个 Ct（DNA Standards）绘制标准曲线。若 Ct （DNA Standard 4）+ 3 > Ct （NTC），提示定量体系存在严重污染，需更换体系中所有组分后重复试验。

3)绘制的标准曲线相关系数 R2 应不低于 0.99，斜率应位于 -3.1 至 -3.6 之间（表示扩增效率位于 90%-110% 之间）。如标准曲线参数不佳，应重复试验。

2.文库长度矫正

稀释文库的 Ct 只有位于标准曲线有效 Ct 范围之内才可用于浓度计算，同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度（nM）：

原始文库浓度（nM）= [450 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）× 稀释倍数/1000

六、使用案例

用 Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜盐杆菌基因组 DNA 文库，文库 GC 含量为 70%，长度450 bp。将文库稀释 10000 倍上机检测，结果如下图所示。根据标曲及公式，文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数 10000=43.7 nM。

HB210510