活体成像试剂（D-Luciferin and Coelenterazine）
— — 生物化学发光检测法（荧光素酶）
背  景：
活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，zui常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。
原  理：
常见的荧光素酶有两种，分别是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，编码基因是luc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，编码基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它们共同的作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光（不同底物光的颜色和波长不同），当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。
产  品：
化学发光底物1：D-Luciferin
美国Goldbio公司提供几种常用类型的D-Luciferin，每批试剂都经过严格的质量验证（经9次独立的HPLC和FTIR标准法监测）和发光效率检测，确保客户每次试验的高重复性和成功性。所有产品都可用于体内成像分析和体外化学发光检测实验。Goldbio的D-Luciferin是合成的萤火虫荧光素，结构与promega公司提供的甲虫荧光素一致，是水溶性的萤火虫荧光素酶底物。
（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D荧光素钠盐
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O  分子量：320.32 g/mol   纯度：纯（99.7%）
应 用：1）体外化学发光分析（in vitro）；2）活体成像实验（in vivo）；3）高灵敏度ATP分析；
步 骤：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）用33.3 mL蒸馏水溶解1.0 gD-荧光素钠盐，配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2）用组织培养基1∶200稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基。
4）待图像分析前，向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活体成像分析
1）用无菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钠盐工作液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取决于注射方式，具体如下：

3）注射入体内5-10分钟后，进行成像分析。
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（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-荧光素钾盐;
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O    分子量：320.32 g/mol   纯度：纯（99.7%）
应用：1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
       2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2）用预热好的组织培养基1∶200稀释储存液，配制工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基直至无残留。
4）图像分析前立即向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析（或者细胞放在37℃短时间孵育后检测可增强信号）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活体成像分析
1）用无菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钾盐溶液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g体重的浓度向每支小鼠注射相应量的15mg/mL荧光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后进行成像分析。（对每只动物模型做荧光素动力学研究以确定峰值信号获取时间）
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（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-萤火虫荧光素
分子式：C₁₁H₈N₂O₃S₂  分子量：280.330 g/mol  外观：白色至浅黄色粉末
溶解：0.25%浓度溶解于甲醇，形成近乎无色至浅黄色的清夜
保存：-15°C 避光
应用：1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
      2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；
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使用GBT公司荧光素（Luciferin）发表的文献:
1. Barth et al. Molecular Therapy. 2008, 16. 957-964.
2. Mahller et al. Cancer Research. 2008, 68 (4). 1170-1179.
3. Marques et al. Journal of Neurovirology. 2008, 14 (3). 229-238.
4. Stish et al. J. Neurooncol. 2008, 61 (1). 51-61.
5. Zhang et al. Cancer Research. 2007, 67. 9389-9397. 6. Baia, G. et al, Brain Pathology, 2007, 18 (2), 172-179.
7. Barth, A. et al, Molecular Therapy, 2008, 16 (5), 957-964.
8. Su Y. et al. Clinical and Experimental Metastasis, 2009
化学发光底物2：Coelenterazine
美国Goldbio提供三种coelenterazine类似物，分别是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。虽然三种都可用于相同实验，但是得到的结果有差异。
Coelenterazine：普遍认为是天然的腔肠荧光素，是海肾荧光素酶（Rluc）的作用底物，具有许多用途。可用于检测活细胞中钙离子浓度，基因报告分析，BRET（生物发光共振能量转移）研究，ELISA，HTS，组织或细胞中超氧阴离子和过亚硝酸盐的化学发光检测。
Coelenterazine h:与Renilla荧光素酶或Gaussia荧光素酶使用具有一定的局限性。体外研究中比其他类似物更适合与钙离子激活发光蛋白共用。据报道，Coelenterazine h的发光强度高于天然腔肠荧光素10-20倍，因此是用来检测钙离子浓度微小变化的有力工具。
Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的底物，此腔肠素衍生物在390 nm和400nm之间发蓝色光，对GFP acceptor的光发射干扰zui小。
（1）Coelenterazine（天然腔肠荧光素）
分子式：C₂₆H₂₁N₃O₃    分子量: 423.48 g/mol   纯度：95%  保存：-15°C避光，保存在惰性气体下
Protocol：发光检测实验
1）使用管光度计室温下定量检测发光情况，每个样品做三个平行；
2）加入底物10s内立即检测，“integration time”为1 s；
3）对于细菌表达Gluc系统，甲醇溶解底物腔肠素制备10 mM储存液，终浓度为10μmol/L。储存液-20 °C保存，工作液制备过程需避光并置于冰上。
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（2）Coelenterazine 400 a/腔肠素400a
分子式：C₂₆H₂₁N₃O   分子量：: 391.48 g/mol     纯度：95%
储存液制备：
1）开封前将瓶子放到室温温育，以避免产品发生任何的冷凝；
2）用125 μL无水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，zui终浓度是0.4μg/μL. ，轻轻混匀；（注：避免用DMSO或其他溶剂来溶解腔肠素400a，因为试剂可能被氧化）
3）分装后避光保存在-20°C，保持干燥；
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（3）Coelenterazine h/ 腔肠素h（from Caliper LifeScience Inc.）
RediJectCoelenterazineh为即用的注射型生物发光底物，特别设计用于体内成像研究。通过zui小化产品成分的变化，zui小化冻融次数和严格控制不同批次的产品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能确保客户得到高重复性的结果。
优  点：
◆预制配方，不同批次间严格控制特别设计用于体内研究；
◆即用型产品通过zui小化预成像准备步骤，减少时间和精力；
◆每瓶可用于5只动物的成像研究；（10 瓶/kit）
◆经IVIS成像系统验证，控制体内成像质量；
颜色：黄色溶液（溶于丙二醇/柠檬酸盐）
浓度：150 μg/mL （10瓶无菌溶液，每瓶含1.2 mL浓度为150 μg/mL的Coelenterazine h ）
保存： Store at ≤ -70 °C。
使用及注射剂量：
开始实验前，37 °C水浴锅解冻，避免重复冻融。静脉注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1. 静脉注射：推荐使用剂量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接从瓶内吸取溶液，然后用25 gauge或更高的针头注射入小鼠体内。尽快成像检测以获得峰值信号。
2. 腹腔注射：推荐剂量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

应用实例：
   
                                      
Figure 1. RedijectCoelenterazine has been optimized for in vivo use with IVISimaging systems. (A) 5 pmol BRET Qdot 700* were injected intravenouslyin a nu/nu mouse. 10 minutes post BRET Qdot injection 15 μg/mouseCoelenterazine h was injected intravenously. Chart shows peak signal wasobserved right after injection at ~ 22 seconds followed by rapidclearance. Images were taken with IVIS kinectic. (B) 1,2 and 4 pmol BRETQdot 655 were injected subcutaneously in a nu/nu mouse. 10 minutes postBRET Qdot injection 10 μg/mouse Coelenterazine was injectedintraperitoneally. Chart shows that peak signal was reached around 27minutes post i.p. injection of Coelenterazine.
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