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Picogreen dsDNA定量检测
2015-11-20 阅读(3537)
关键词：dsDNA、双链DNA、dsDNA定量、荧光核酸染料、A260、DNA残留
Picogreen dsDNA双链DNA（dsDNA）定量检测
检测原理
Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建，DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义。疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。
Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。可用荧光分光光度计或荧光酶标仪读数，Ex/Em=480nm/520nm。
产品优势
相比传统的方法，如紫外吸光法（A260）、探针杂交法、Hoechst 33258染料法等，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：
①灵敏度高：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省宝贵的样品；
②特异性强：在等摩尔的RNA存在的条件下，对dsDNA具有特异性；
③耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。
④易于使用——只需在样品中加入染料，等待5分钟，然后读数即可，且适用于96和384孔板；与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。
⑤适用范围广：可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。
产品应用
测定微量的DNA残留（如疫苗生产）；对DNA样品进行定量
运输和保存方法
室温运输。4℃避光干燥保存，有效期6个月。
检测步骤【以双链DNA定量检测试剂盒为例】
1、2μg/ml的Calf thymus DNA standard浓缩液的配制
用1×TE对Calf thymus DNA standard (100μg/ml)进行50倍稀释，即向30μl Calf thymus DNA standard加入1.47ml 1×TE混匀即可。
2、标准曲线的制备
① 比色皿体系检测（2ml）
a、按照表1 向一次性微量比色皿中加入TE和2μg/ml Calf thymus DNA standard，随后加入1ml PicoGreen定量试剂，混匀后，于室温避光孵育2-5min，并以1×TE缓冲液为blank。【注】：确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。
表1 比色皿体系所需加入各组分量及标准品终浓度表
TE (μl) | 2μg/ml Calf thymus DNA standard (μl) | 稀释的PicoGreen定量试剂 (μl) | Calf thymus DNA standard终浓度 |
0 | 1000 | 1000 | 1μg/ml |
900 | 100 | 1000 | 100ng/ml |
990 | 10 | 1000 | 10ng/ml |
999 | 1 | 1000 | 1ng/ml |
1000 | 0 | 1000 | blank |
b、于荧光仪中检测各浓度荧光值，Ex/Em=480nm/520nm。
【注】：为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内，应调节增益使含zui高DNA浓度的样品荧光值与荧光仪的zui大值一致；为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。
c、各浓度得到的荧光值减去空白对照荧光值，对DNA浓度和荧光值做标准曲线。
② 微孔板体系检测（200μl）
a、按照表2 向96孔板中加入TE和2μg/ml Calf thymus DNA standard，随后加入100μl PicoGreen定量试剂，混匀后，于室温避光孵育2-5min，并以1×TE缓冲液为blank。【注】：确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。
表2酶标板体系所需加入各组分量及标准品终浓度表
TE (μl) | 2μg/ml Calf thymus DNA standard (μl) | 稀释的PicoGreen定量试剂 (μl) | Calf thymus DNA standard终浓度 |
0 | 100 | 100 | 1μg/ml |
90 | 10 | 100 | 100ng/ml |
99 | 1 | 100 | 10ng/ml |
99.9 | 0.1 | 100 | 1ng/ml |
100 | 0 | 100 | blank |
b、于荧光酶标仪中检测各浓度荧光值，Ex/Em=480nm/520nm。
【注】：为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内，应调节增益使含zui高DNA浓度的样品荧光值与荧光仪的zui大值一致；为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。
c、各浓度得到的荧光值减去空白对照荧光值，对DNA浓度和荧光值做标准曲线。
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