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NGS文库质检方法与注意事项
2018-1-3 阅读(1756)
HB170102
【技术帖】NGS文库质检方法与注意事项
——文库大小、质量、污染物评测
文库的质量对于高通量测序（NGS）产出的数据质量至关重要。过低估计文库的质量，导致Clusters或多重模板太多，数据质量不高；过高估计文库的质量，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或者高估文库质量都会影响测序效果。
那么，如何判断你做出来的文库是可以用于上机测序的，而不是白费力气建了个没用的文库？或者更糟糕，构建出的文库可以上机测序，但是得到了一堆没有用的数据？
不要担心，如果你的实验设计精良，你只需要做3步简单的质控就可以判断文库是否合格。
Bioanalyzer——文库长度检测
qPCR/Qubit——文库定量
Nanodrop——文库污染物检测
1. 文库长度检测
文库长度检测是文库质控的关键步骤。测序上机时，要求文库等摩尔上样（否则可能造成不同文库簇生成密度不同，而影响测序质量），文库的平均长度是计算文库摩尔数的要素之一。
文库摩尔数（pmol）≈ 文库质量(ng)/ [0.66×文库平均长度（bp）]
Agilent Bioanalyzer是进行文库长度检测zui常用的仪器，它基于微控流技术对样本进行分离检测。根据加样要求，在DNA芯片中加入Ladder、Marker、Gel、Dye以及Sample，当给芯片加入电压时，样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳，在样本流动过程中，不同DNA根据其大小被分离。同时凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入DNA双链，通过激光激发荧光，使其被仪器检测到，仪器依据收集到的荧光信号强度对样本粗略定量。
一般情况下，好的文库应该呈现出单一的、圆滑的峰，且接近正态分布，长度范围在150-700bp之间。如下图为使用100 ng E.coli gDNA建库，接头连接后进行双轮分选（0.6×/0.2×和0.55×/0.15×）的检测结果。
有时，文库也可能在150-700bp的范围之外出现杂峰。不同的杂峰大小与峰形可参照以下情况进行分析和实验改进。
1) 在150bp以下出现杂峰
这种情况可认为是文库扩增时的引物二聚体残留或接头残留导致的，可以通过稍微降低磁珠使用比例重新纯化文库解决。注意，磁珠使用过程中的移液操作，切勿扰动磁珠。
2）在700bp以上出现杂峰
这种情况可认为是文库扩增循环数过高，出现文库过度扩增自我交联导致的，可以通过文库重新分选解决。
3）整个文库呈现大小不对称
这种情况可认为文库分选操作不良或Input DNA的片段化不*导致的，可以通过重新进行文库分选或者重新构建文库解决。
2. 文库浓度检测
文库质量也是计算文库上机摩尔数的要素。常规使用qPCR法和荧光计法（以Qubit®常用）。
1）qPCR法
qPCR法使用特异性引物仅定量样品中两端接头连接完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，是目前业内进行文库定量的金标准。使用qPCR法时，需要以不同浓度的已知长度DNA的片段（常为452bp）作为标准品进行标曲制作，进而进行文库定量。
由于标准品与文库的实际长度可能不同，因此计算时，需要对文库质量进行校正。
原始文库浓度（nM）= [452 bp /文库平均长度（bp）] × 稀释文库的浓度（pM）× 稀释倍数/1000
一般情况下，理想的文库浓度应在10-100nM之间。如果文库测定结果在100nM以上，表明文库的PCR循环数过高，这可能会增加测序数据中的Duplicate rate，此时可以通过减低1个PCR循环数来获得10-100nM之间的文库。
为了获得的定量结果，在使用qPCR方式进行文库定量时，建议遵循以下原则：
Ø 等量分装qPCR Mix和DNA标准品，避免模板污染和反复冻融的影响
Ø 在进行qPCR之前，将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离，并定时使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。
Ø 待测样本做梯度稀释，并且同时做3个平行重复
Ø 检查梯度稀释液以及平行样本具有一致性的可重复的测定值
Ø 检查确定待测文库Ct在标准曲线以内时，使用标准曲线计算文库浓度
2）荧光计法（Qubit®, Picogreen）
Qubit®是核酸和蛋白定量荧光仪，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，能够对DNA和RNA进行定量。Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，其仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，是定量DNA文库的zui常用染料。
由于染料与DNA双链结合，但无法有效区分文库双链和其他不完整双链结构（如单端连接接头产物或未连接接头产物），所以相对qPCR法定量文库来说，Qubit®方法的度稍弱一些，但是Qubit®出众的简便性、灵敏度以及低成本使得Qubit®成为测序实验室*的仪器之一。此外，Input DNA由于没有添加接头，是无法使用qPCR方式定量的，此时Qubit®方法相对其他如Nanodrop等方法来说，是zui为的方法。
使用Qubit®荧光计方法得到的文库浓度以ng/μL为单位，而测序上机文库以nM（nmol/L）为单位，因此测定值需要根据以下公式进行换算：
文库摩尔数（nM）≈ 文库质量(ng/μL)×106/[660×文库平均长度（bp）]
3. 文库污染物检测
Nanodrop是检测样本污染物zui快的方法之一，能够在包括紫外及可见光区域在内的光谱范围内检测污染物的吸光度信号，核酸污染物的常用参考标准是A260/280和A260/230。
理想文库的标准是A260/280>1.8，A260/230>2.0，不在该范围时，建议重新进行文库纯化或者重新建库，否则，可能造成文库簇生成量少，测序数据质量差。
需要注意，不要使用Nanodrop做建库过程中的DNA或RNA定量！
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