观察精卵受精原核操作常识

• 在精子卵子授精后14-19小时期间观察原核。
• 操作环境：百级净化环境中操作，配备温度37℃加热板的体视镜下观察。
• 挑选合适尖吸管用于剥离“受精卵”外层卵丘细胞（可实验自制或者购买剥卵针），尖吸管内直径稍微大于卵母细胞的直径。使用尖吸管前请在体视镜观察尖吸管头部是否完好和内直径是否合适（管内直径120微米左右）。
• 取卵当日为每个IVF/ICSI患者准备胚胎培养皿，每个培养皿周围用卵裂液（如G1，或Gm）做8-10个微滴，中间3-4个微滴备冲洗，每个胚胎培养微滴用液约15ul，其上盖满 矿物油。将准备好的胚胎培养皿放入CO2 培养箱内平衡通宵。
• 了解患者通宵精子的情况：如未提示通宵精子培养液中未见较多密集的颗粒状物，可以开始观察原核操作；如提示通宵精子培养液中可见较多密集的颗粒状物，可能发生“受精卵”污染，请zui后观察，具体操作见补充说明。
• 准备以上条件后，从培养箱取出患者授精的4孔培养皿，与实验室记录单核对夫妻双方名字及核对所观察的的“卵子”数目。
• RT受精卵的原核检查，需先剥除外层卵丘细胞。使用前尖吸管可用授精培养液体润洗下。体视镜下，尖吸管在授精孔吹吐“受精卵”，剥离“受精卵”外层卵丘细胞。开始时，先剥离一个“受精卵”，如顺利，之后可以3-4个受精卵一起剥离。
• 原核检查：剥离颗粒细胞后，使用尖吸管将卵母细胞转入备好的胚胎培养皿内（ICSI受精卵直接转入胚胎培养皿内），在体视镜下（80X）进行原核观察，如解剖镜下显示不清需在倒置镜下（200X）下观察。
• 将受精卵在中间3个培养滴进行清洗后，按2PN，1PN，0PN（无原核，可为2pb，MII），MI，GV，3PN/多PN（3个以上原核）等受精情况情况进行分类放置，每个培养滴放1-5枚胚胎（如果胚胎数超过30建议使用2个及以上培养皿）。标记核对患者夫妻双方名字于胚胎培养的小皿，与患者四孔培养皿一直放入培养箱，位置与原来相同。作好受精情况记录，记录包括受精情况，位置，培养液，观察时间，操作者。
• 如果“受精卵”剥离和观察是在空气环境下，此操作过程不能超过十分钟。
• 一位患者受精观察结束后销毁使用过的尖吸管，开始下一位患者的观察。

补充说明

1．常规受精失败或常规受精率低于20%：观察未受精卵成熟情况；了解通宵精子的情况，及四孔精子情况，判断是否补救ICSI，和是否发生污染。

2．补救ICSI：如果常规受精失败，或受精率低于20%。

●原则是尽可能保证患者有一次胚胎移植机会。

●常规受精*失败视卵成熟情况和卵子质量好坏决定是否进行补救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2，受精卵形态正常，可以考虑不补救ICSI。

如果正常受精2PN＜2，且有5个以上正常形态MII，建议补救ICSI。

●及时补救ICSI。

●如补救，第二天请先观察补救ICSI受精情况。

3．污染问题：

污染提示：

• 通宵精子培养液中见较多密集的颗粒状物。
• 受精的4孔培养液有浑浊的情况发生。
• 常规受精*没有受精。

污染观察：倒置显微镜下（200X或400X）下观察确认。

污染处理：*种情况: 4孔培养液中布满大量的颗粒状物，精子大多数不活动，颗粒细胞贴壁生长差，可以当日行精液及胚胎培养液的细菌培养鉴定及药敏实验

第二种情况:如上述情况不是很明显，到D3移植日再观察决定。这种情况下如果常规*未受精可以行补救ICSI。

D3观察：●胚胎培养滴中未发现颗粒，移植。

 ●胚胎培养滴中发现颗粒，不移植，精液及胚胎培养液的细菌培养鉴定及药敏实验。

 ●胚胎培养滴中难以确定颗粒，囊胚培养后决定？胚胎冷冻，胚胎胚胎培养液的细菌培养鉴定？ 

初步判断污染来源：

●提示精子来源污染；

通宵精子培养液有明显大量颗粒，培养卵母细胞的四孔中间背景干净，浸洗卵母细胞培养皿背景干净。

●提示卵子来源污染；通宵精子培养液未见较多密集的颗粒状物，且精子活力良好，培养卵母细胞的四孔中间可见较多密集的颗粒状物，浸洗卵母细胞培养皿背景可见较多密集的颗粒状物。

补充

1．常规受精失败或常规受精率低于20%：观察未受精卵成熟情况；了解精子的情况，及四孔精子情况，判断是否补救ICSI，和是否发生污染。

2．补救ICSI：如果常规受精失败，或受精率低于20%。

●原则是尽可能保证患者有一次胚胎移植机会。

●常规受精*失败视卵成熟情况和卵子质量好坏决定是否进行补救ICSI。

●受精率低于20%：

如果正常受精2PN≥2，受精卵形态正常，可以考虑不补救ICSI。

如果正常受精2PN＜2，且有5个以上正常形态MII，建议补救ICSI。

●及时补救ICSI。

●如补救，第二天请先观察补救ICSI受精情况。

3．污染问题：

污染提示：

• 精子培养液中见较多密集的颗粒状物。
• 受精的4孔培养液有浑浊的情况发生。
• 常规受精*没有受精。

污染观察：倒置显微镜下（200X或400X）下观察确认。

污染处理：*种情况: 4孔培养液中布满大量的颗粒状物，精子大多数不活动，颗粒细胞贴壁生长差，可以当日行精液及胚胎培养液的细菌培养鉴定及药敏实验

第二种情况:如上述情况不是很明显，到D3移植日再观察决定。这种情况下如果常规*未受精可以行补救ICSI。

D3观察：●胚胎培养滴中未发现颗粒，移植

●胚胎培养滴中发现颗粒，不移植，精液及胚胎培养液的细菌培养鉴定及药敏实验。

●胚胎培养滴中难以确定颗粒，囊胚培养后决定？胚胎冷冻，胚胎胚胎培养液的细菌培养鉴

 初步判断污染来源：

●提示精子来源污染；

精子培养液有明显大量颗粒，培养卵母细胞的四孔中间背景干净，浸洗卵母细胞培养皿背景干净。

●提示卵子来源污染；精子培养液未见较多密集的颗粒状物，且精子活力良好，培养卵母细胞的四孔中间可见较多密集的颗粒状物，浸洗卵母细胞培养皿背景可见较多密集的颗粒状物。