精子活力和顶体反应三色（triple staining）染色试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
精子活力和顶体反应三色（triple staining）染色试剂是一种旨在使用台盼蓝、孟加拉红和俾斯麦棕Y三种染料特异性着色死亡精子、完整顶体以及顶体后区，产生蓝、红棕色，从而确定细胞活力以及精子功能（顶体反应）的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物或人体精子细胞。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，着色清晰。
技术背景
在学（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子寿命、以及生育能力的基础信息。其中精子的活力（vitality）、运动能力（motility）、授精潜力（fertilizing potential）、膜结构完整性（integrity）、顶体反应（acrosomal reaction）功能的评价是精子分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要参数。其中顶体反应，是指当精子接近卵子实施授精时，精子头部前半端的帽状结构顶体，释放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。顶体反应测试是一项稳定的精子功能参数，可以用于预测受精成功率。因此顶体的结构完整性（intact）是评价的主要标志，也是不育症和药物研究的对象。三色（triple staining）染色首先使用台盼蓝（trypan blue）染色，分析精子活力，基于台盼蓝受到活体精子细胞（包括游动性和非游动性精子）的排斥，而死亡精子细胞摄入染料显示红色的原理。其次使用孟加拉红或虎红（Rose Bengal）染料与顶体内含物的结合，区别完整性（未反应性unreacted）顶体，以及俾斯麦棕Y（Bismark Brown Y）染料识别顶体后区（post-acrosomal region）染色。通过常用的一般光学显微镜（无需相差显微镜；phase-contrast microscope）便可清晰观察到顶体缺失状态。
产品内容
一染液（Reagent A） 毫升
清理液（Reagent B） 毫升
固定液（Reagent C） 毫升
二染液（Reagent D） 毫升
三染液（Reagent E） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避光，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
恒温水槽或培养箱：用于孵育反应
微型台式离心机：用于样品操作
血细胞计数器：用于细胞计数 1
盖玻片：用于精子细胞爬片
一般光学显微镜：用于观察染色的精子细胞
实验步骤
1． 移取新鲜获得的精液（30分钟至1小时内）到1.5毫升离心管
2． 放进37℃恒温水槽孵育30分钟
3． 轻柔涡旋震荡5秒
4． 移取xx微升上述精液到新的1.5毫升离心管
5． 加入xx微升一染液（Reagent A）
6． 用200微升枪头上下抽吸混匀
7． 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
8． 即刻移取xx微升到洁净的载玻片
9． 盖上盖玻片
10．即刻在一般光学显微镜下（1000倍；即油镜下）观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）
蓝色染色的精子细胞为死亡细胞，而不染色的精子细胞为活体细胞
11．将1.5毫升离心管放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
12．小心抽掉上清液
13．加入xx微升清理液（Reagent B），混匀
14．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15．小心抽掉上清液
16．加入xx微升固定液（Reagent C），混匀
17．室温下孵育60分钟
18．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19．小心抽掉上清液
20．加入xx微升清理液（Reagent B），混匀
21．即刻移取12微升到洁净的载玻片一端
22．用盖玻片或另一个载玻片推片
23．置于空气中凉干
24．小心加上xx微升二染液（Reagent D）在载玻片上，覆盖样品表面
25．放进40℃恒温培养箱孵育5分钟
26．即刻移去二染液（Reagent D）
27．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在载玻片上，覆盖样品表面
28．即刻移去清理液（Reagent B）
29．小心加上xx微升三染液（Reagent E）在载玻片上，覆盖样品表面
30．室温下孵育30分钟
31．即刻移去三染液（Reagent E）
32．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在载玻片上，覆盖样品表面
33．即刻移去清理液（Reagent B）
34．封片
35．即刻在一般光学显微镜下（1000倍；即油镜下）观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）
粉红色顶体和浅棕色顶体后区――活体精子未反应完整顶体
无色顶体和浅棕色顶体后区――反应后顶体（或顶体缺失）――阳性顶体反应
蓝色精子细胞、粉红色顶体和浅棕色顶体后区――死亡精子未反应完整顶体
无色顶体和无色顶体后区――死亡或冻存后、损伤后精子退化顶体（或顶体缺失）
注意事项
1． 本产品为50次操作
2． 操作时须戴手套
3． 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数，同时观察精子游动
4． 精子细胞计数时乘上稀释倍数104。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：
1毫米方块的细胞计数X 104（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升
5． 避免一染液（Reagent A）染色时间超过15分钟，否则由于其毒性导致精子细胞死亡
6． 本产品可用于染色稀释过的或冻存过的精子细胞
7． 本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定着色清晰