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DSY5000X荧光显微镜

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第五节  荧光显微镜（Fluorescence microscope）

荧光显微镜是用人眼不可见的一定波长的紫外线作光源照射被检物体，使之受激发后而产生人眼可见的荧光，然后再经显微镜成象系统放大来进行镜检。荧光显微术是生物、医学中的重要研究工具，如对生物组织、生理、病理、微生物、医药、食品、化学等诸方面的鉴定等。

一、基本原理

    （一）荧光：普通光是由发光体质点的热运动所引起的幅射；而荧光是非温度幅射，是一种冷光。荧光有多种，如光化荧光（由光源激发而产生的荧光）、放射荧光（由放射性物质激发而产生的荧光）、生物荧光（生物体发出的荧光）、化学荧光（如磷的氧化时发出的荧光）等等。而荧光显微镜则是利用“光化荧光”这一原理设计制造，达到荧光显微术镜检的目的。

由于荧光显微镜的光源是利用人眼不可见的短波光——紫外线，因而就大为提高了物镜的分辨率，图象与背景的反差亦甚为明显。

（二）荧光现象：将荧光物体放到光谱中的各色区域，就可艰现引起荧光有效的光线是光谱上波长较短的区域，即近紫外线区域，波长约0.32~0.40um。这种现象的实质是分子吸收了短波光的能量（波长越短，光能越强），又以发光的形式以波长较长的荧光射出，而为人眼可见，这就是“荧光现象”。荧光接近可见光的红端，大部分的荧光现象是符合这一规律的。荧光现象可分为两种：

1）一次荧光现象：又称“固有荧光”或“自发荧光”，当经紫外线的照射后，就能发出荧光的物质而谓之；

2）第二次荧光现象：又称“继发荧光“，当经紫外线照射后不能或只部分发生微弱的荧光，这样就需先用荧光素处理，再经紫外线照射才能发生荧光，这是因组织内吸附或溶解有荧光素的缘故。

荧光色素的种类甚多，大部分为制片技术中所用的染色剂，对各种被检物体表现出不同的亲和性。因此，对荧光色素的选择、应用浓度及处理时间等诸方面都需摸索和积累经验。

二、荧光显微镜的装置

   荧光显微镜在装置上的重要部件就是要有能提供充分的特定波长的光源装置，使被检物体得到理想的激发而发出强的荧光。为达到这一要求，均借助滤光片把激发的光谱限定在这一特定的波长区域内，而把伴随发出的可见光全部吸收或反射掉。此外，为了提高荧光镜检的效果，对聚光镜（透射式用）、载玻片、盖玻片和物镜均有一定的要求。

   荧光显微镜的装置有透射击式和落射式两种类型。

   （一）透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗场聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视场背景。透射式不适用于非透明的被检物体。

   （二）落射工：新型 的荧光显微镜多为落射式，在光路中具有分光镜，光源来自被检物体的上方，故对透明与非透明的被检物体都适用。由于物镜起到了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍可以实现整个视场的均匀照明，但它在低倍情况下则暗，而高倍则明。

    三、激发滤色镜的选择与荧光色至少的应用

   生物体的各种组织、不同的细胞、细胞器、微生物、病毒等等，对激发光的选择是很重要的，这可利用不同的激发滤色镜来达到佳的激发光源。在荧光色素的应用上也如此，必须应用适合某种被检物体的荧光素，才以获得满意的观察效果。现将一些应用实例列表于下，仅供参考：

注：U激发-紫外激发   V激发-紫色激发  B激发-蓝色激发  G激发-绿色激发

   3）蛋白粘贴剂不能用以荧光色素处理的材料，因蛋白能为荧光色素染色，而发生附加荧光。

   4）如为石蜡制片，脱蜡必须*，因石蜡有青色荧光，切片进入水后，应充分水洗，再经荧光色素处理，用水封固进行镜检。

   5）载玻片、盖玻片好为萤石玻璃制成，如为普通玻璃，要色泽洁白，厚度要符合标准。同是不能有灰尘及有机物质否则将会发生荧光而干扰政党的镜检效果。

   6）不能用加拿大树胶作封固剂，因其本身具有青黄色荧光，可用甘油、甘油胶、糖浆及阿拉伯树胶封固。