白介素-5 ELISA KIT

白介素-5 ELISA KIT是科研中用于定量检测生物样本里白介素 - 5 含量的关键工具，为深入探究免疫反应、炎症机制等提供有力支持。

1. 检测原理：运用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法。试剂盒的酶联板预先包被了针对 IL-5 的特异性抗体。当加入样本后，样本中的 IL-5 与固相抗体特异性结合。接着加入酶标记的抗 IL-5 抗体，形成 “固相抗体 - IL-5 - 酶标抗体" 复合物。经洗涤去除未结合物，加入底物溶液（如 TMB），在酶催化下，底物发生显色反应，颜色深浅与样本中 IL-5 含量成正比。通过酶标仪在 450nm 波长处测量吸光度，与标准曲线对比，从而计算出样本中 IL-5 的浓度 。

2. 试剂盒组成

• 酶联板：有 96 孔或 48 孔，预包被抗 IL-5 抗体，是反应的载体。

• 标准品：一般为冻干品，通常有 2 瓶。临用前需用标准品稀释液复溶，并稀释成不同浓度梯度，如 0、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500 pg/mL 等，用于绘制标准曲线 。

• 样本xi释液：用于稀释浓度过高的待测样本，确保样本浓度在试剂盒检测范围内。

• 酶标抗体：即 HRP 标记的抗 IL-5 抗体，为浓缩液，使用时需按要求用酶标抗体稀释液稀释。

• 酶标抗体稀释液：专门用于稀释酶标抗体。

• 底物溶液：如 TMB 底物，与酶标抗体中的 HRP 反应产生颜色变化。

• 洗涤液：多为浓缩液，使用时需按比例用蒸馏水或去离子水稀释，用于洗涤酶联板，去除未结合物质，降低背景干扰。

• 终止液：一般为强酸溶液（如硫酸），用于终止底物的显色反应，使反应液颜色稳定，便于读数。

• 封板膜：温育时覆盖酶联板，防止液体蒸发和外界污染。

• 使用说明书：详细介绍试剂盒的使用方法、注意事项、性能指标等。

3. 样本要求

• 血清：采集血液后，室温放置 2 小时或 4℃过夜，1000×g 离心 20 分钟，取上清备用。采血应使用无热原、无内毒素的一次性器材 。

• 血浆：可用乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素等抗凝剂。样本采集后 30 分钟内，在 2 - 8℃下 1000×g 离心 15 分钟，取上清 。

• 细胞培养上清：将细胞培养上清 1000×g 离心 20 分钟，去除细胞碎片和杂质后，取上清用于检测 。

• 组织匀浆：用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M，pH = 7.4）冲洗组织，去除残留血液。剪碎组织后，按 1:9（w/v）加入 PBS，在冰上充分研磨。再经 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清用于检测 。

• 样本采集后若短期内检测，可保存于 4℃；若需长时间保存，需置于 - 20℃或 - 80℃冻存，且要避免反复冻融，溶血样本一般不适合检测 。

4. 操作流程

• 准备工作：从冰箱取出试剂盒，提前 30 分钟平衡至室温。同时，将浓缩洗涤液按要求比例用蒸馏水或去离子水稀释备用 。

• 加样：设置空白孔、标准品孔和样本孔。空白孔加入样本xi释液，标准品孔加入不同浓度的标准品，样本孔加入处理好的样本，每孔加样量通常为 100μL，轻轻混匀，37℃温育 90 分钟 。

• 洗涤：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液加满各孔，浸泡 1 - 2 分钟后甩干，重复洗涤 5 次，确保che底洗净未结合物质 。

• 加酶标抗体：每孔加入 100μL 稀释好的酶标抗体工作液，37℃温育 60 分钟 。

• 再次洗涤：重复上述洗涤步骤 。

• 显色：每孔加入 90μL 底物溶液，轻轻混匀，37℃避光显色 15 - 30 分钟（需根据实际显色情况判断） 。

• 终止反应：每孔加入 50μL 终止液，此时溶液颜色由蓝色变为黄色 。

• 读数：在加终止液后 15 分钟内，用酶标仪在 450nm 波长处测量各孔的吸光度（OD 值） 。

• 计算结果：以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样本的 OD 值从标准曲线中查出对应的浓度，若样本进行了稀释，需乘以相应的稀释倍数，从而得到实际浓度 。