详细介绍
一、细胞基本属性:
细胞名称 | 小鼠阴道真皮成纤维细胞 | 商品货号 | A01X1891 |
种属来源 | 小鼠 | 产品规格 | 5×105cells/T25细胞培养瓶 |
原代细胞实验步骤:
一、取7-10d雄性SD大鼠,颈椎脱臼处死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
二、在超净工作台中,将大鼠断头置于玻璃培养皿中,打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中,去除小脑和间脑。
三、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管,再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。
四、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜,保留大脑皮质。
五、大脑皮质放于DMEM中,剪碎成约1mm3大小,放入50ml的离心管中,加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型胶原酶,0 .025-0 .05%IV型胶原酶,200-400U DNaseI),混匀后37℃水浴消化1-1.5h。
六、室温1 000×g离心8min,去上清液。
七、沉淀中加入20%BSA重悬浮,充分混匀,1 000×g,20min,4℃离心,去上清。
八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的胶原酶/分散酶,0.05-0.1%I型胶原酶,100-300U DNaseI )重悬浮,混匀,37℃水浴消化0.5-1h,700×g室温离心6min,去上清液。
九、沉淀加入2ml DMEM培养液悬浮混匀,铺于经离心形成连续梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g,60min,4℃),1000×g,4℃离心10min。
十、靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段,吸出后DMEM
漂洗两次(离心1000×rpm,6min,室温),去上清液。
加入DMEM培养液(20%FBS,4ug/ml嘌呤霉素 )重悬浮,接种于含5%的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中,置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基,随后隔天换液。
原代细胞使用方法:
是一种贴壁细胞,细胞形态呈内皮细胞样,在技术部标准操作流程下,细胞可传2-3代;建议您收到细胞后尽快进行相关实验。
客户收到细胞后,请按照以下方法进行操作。
1. 取出T25细胞培养瓶,用75%酒精消毒瓶身,拆下封口膜,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h,以稳定细胞状态。
2. 贴壁细胞消化
1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次;
2)添加0.25%消化液1mL至T25培养瓶中,轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后,吸出多余消化液,37℃温浴1-3min;倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆后,再加入5ml培养基终止消化;
3)用吸管轻轻吹打混匀,按传代比例接种T25培养瓶传代,然后补充新鲜的培养基至5mL,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养;
4)待细胞贴壁后,培养观察;之后按照换液频率更换新鲜的培养基。
3. 细胞收货脱落
1)收集所有细胞悬液,1000rpm,离心5min,保留沉淀;
2)添加0.25%消化液0.5mL至离心管中,重悬沉淀,放置于37℃消化3min(或4℃冰箱静置5-7min);消化完向离心管内加入5ml培养基终止消化;
3)经1000rpm,离心5min,丢弃上清,用5ml培养基重悬沉淀,接种于新的培养瓶内;
4)待细胞贴壁后,培养观察;之后按照换液频率更换新鲜的培养基(37℃预热)。
5)原瓶内贴壁细胞按正常消化处理。
4. 细胞实验
因原代细胞贴壁特殊性,贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿(如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等)时,需要对实验器皿进行包被,以增强细胞贴壁性,避免细胞因没贴好影响实验;包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ(2-5μg/cm2) ,多聚赖氨酸PLL(0.1mg/ml),明胶(0.1%),依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。
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